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化學發(fā)光生物傳感器法測定食品中有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

文檔作者：王曉朋1, 曾梅1, 萬德慧1, 唐晗1, 趙彬媛2, 周雅倩2, 劉曉宇1, 2* 文檔來源： 1. 華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 2. 環(huán)境食品學教育部重點實驗室,		點擊數(shù)：	更新時間： 2025年06月24日
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上一篇：黃曲霉毒素危害和檢測方法研究進展

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第5 卷 第12 期 食品安全質(zhì)量檢測學報 Vol. 5 No. 12
2014 年12 月 Journal of Food Safety and Quality Dec. , 2014
基金項目: 華中農(nóng)業(yè)大學國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(20130504035)
Fund: Supported by the National Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship of Huazhong Agricultural University
(20130504035)
通訊作者: 劉曉宇, 博士, 教授, 博士生導師, 主要研究方向為食品安全與農(nóng)業(yè)資源綜合利用。E-mail: liuxiaoyu@mail.hzau.edu.cn
*Corresponding author: LIU Xiao-Yu, Professor, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,
China. E-mail: liuxiaoyu@mail.hzau.edu.cn
化學發(fā)光生物傳感器法測定食品中有機磷與氨基
甲酸酯類農(nóng)藥殘留
王曉朋1, 曾 梅1, 萬德慧1, 唐 晗1, 趙彬媛2, 周雅倩2, 劉曉宇1, 2*
(1. 華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院, 武漢 430070; 2. 環(huán)境食品學教育部重點實驗室, 武漢 430070)
摘要: 目的構建一種用于檢測食品中有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的高靈敏度生物傳感器, 建立一種
用于測定食品中兩類農(nóng)藥殘留的新方法。方法以固定化乙酰膽堿酯酶(AChE)為識別元件與底物碘化硫代乙
酰膽堿(ATCI)特異性反應, 采用微流控芯片與化學發(fā)光儀作為檢測元件, 以魯米諾與鐵氰化鉀作為化學發(fā)光體
系, 通過流動注射分析法來檢測農(nóng)藥殘留。結果當有機磷類農(nóng)藥辛硫磷、敵敵畏、樂果濃度范圍分別在
0.1~10、0.08~10、0.8~15 μg/mL 時, 相關系數(shù)分別為0.9923、0.9903、0.9904, 檢出限分別為0.047、0.054、0.388
μg/mL; 當氨基甲酸酯類農(nóng)藥克百威、西維因、滅多威濃度分別在0.08~15、0.1~10、0.1~10 μg/mL 時, 相關系
數(shù)分別為0.9926、0.9972、0.9944, 檢出限分別為0.049、0.051、0.080 μg/mL。傳感器性能評價實驗結果顯示,
在最佳條件下對辛硫磷、敵敵畏、樂果、克百威、西維因、滅多威分別測定6 次, 結果RSD 值均小于7%, 精
密度較好; 以碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)為底物, 連續(xù)通入魯米諾與鐵氰化鉀化學發(fā)光體系6 次, 所得RSD 值小
于8%, 穩(wěn)定性較好; 將實驗制備的固定化AchE 儲存于pH 值為8.0 的磷酸鹽緩沖溶液中, 每隔10 d 測一次化
學發(fā)光峰值, 結果顯示兩個月內(nèi)相對活力下降為23%, 保存時間較長; 將傳感器用于測定包菜、蘋果樣品中的
農(nóng)殘, 添加回收率在90%~99%之間, 顯示精密度較好, 可用于測定食品中的農(nóng)藥殘留量。結論此生物傳感器
性能良好, 適用于測定食品中的有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)殘。
關鍵詞: 有機磷; 氨基甲酸酯; 乙酰膽堿酯酶; 微流控芯片; 化學發(fā)光; 生物傳感器
Determination of organophosphorus and carbamates pesticide residues in
foods by chemiluminescence biosensor
WANG Xiao-Peng1, ZENG Mei1, WAN De-Hui1, TANG Han1, ZHAO Bin-Yuan2,
ZHOU Ya-Qian2, LIU Xiao-Yu1,2*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
2. Key laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, Wuhan 430070, China)
ABSTRACT: Objective To create a high-sensitivity biosensor for detecting organophosphorus and carbamates
pesticides in foods and establish a new method to determine these two kinds of pesticides. Methods
Immobilized acetylcholinesterase (AchE) was used as recognition element of the sensor, reacting specifically
with the substrate of acetylthiocholine iodide(ATCI), the micro-fluidic chip with CL analyzer was used as
4164 食品安全質(zhì)量檢測學報 第5 卷
detecting element, and luminol-potassium ferricyanide system was used in chemiluminescence system.
Results When the concentration of proximal, dichlorvos, dimethoate ranging from 0.1~10, 0.08~10, and
0.8~15 μg/mL, respectively, the correlation coefficients were 0.9923, 0.9903, and 0.9904, and the detection
limits were 0.047, 0.054, and 0.388 μg/mL, respectively. When the concentrations of carbofuran, carbonyl, and
methomyl were ranging from 0.08~15, 0.1~10, and 0.1~10 μg/mL, respectively, the correlation coefficients
were 0.9926, 0.9972, and 0.9944, and the detection limits were 0.049, 0.051, and 0.080 μg/mL, respectively.
The evaluation of biosensor performance indicates good precision, when determining all 6 kinds of pesticides
under optimal conditions, RSD was below 7%; when the substrate of ATCI was injected into
chemiluminescence system 6 times discontinuously, RSD was below 8%, which indicated good stability;
immobilized AChE was stored in phosphate buffer(pH=8.0), detecting activity every 10 d, lasting for two
months, the relative enzymatic activity decreased only 23%, indicating a good storage stability; the biosensor
was used to detect samples of cabbage and apple, fortified recoveries were between 90%~99%. Conclusion
This biosensor has a good performance, therefore it can be used to determine pesticides in foods.
KEY WORDS: organophosphorus; carbamates; acetylcholinesterase; micro-fluidic chip; chemiluminescene;
biosensor
1 引 言
農(nóng)藥的應用對于我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了巨大的
作用, 有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥是其中的重要組
成部分。但是農(nóng)藥濫用的同時也對環(huán)境及人體帶來了
無法避免的危害。有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥俗稱
“神經(jīng)毒劑”, 能與人體興奮傳導物質(zhì)乙酰膽堿的分
解酶乙酰膽堿酯酶特異性結合, 使人痙攣, 嚴重則會
導致死亡[1]。因此, 國家標準規(guī)定了農(nóng)藥使用的限量
標準[2], 而為了執(zhí)行這些標準, 就必須有與之對應的
檢測方法來測定農(nóng)藥殘留, 以判斷農(nóng)藥是否超標。
現(xiàn)行的農(nóng)藥殘留測定方法有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用
技術、高效液相色譜法、波譜法等[3,4], 但這些方法如
高效液相色譜法, 前處理較復雜, 專業(yè)性較強, 設備
成本昂貴, 無法滿足現(xiàn)場檢測、快速檢測的目的。此
外還有免疫分析法、酶抑制率法、速測卡法[5-7]等快
速檢測方法, 也存在對有機磷農(nóng)藥敏感性差、性質(zhì)不
穩(wěn)定的缺點。而應用生物傳感器[8]能夠彌補上述方法
無法滿足的現(xiàn)場、快速檢測的需求。據(jù)文獻報道[9,10],
酶生物傳感器對有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測
有較好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。本研究將化學發(fā)光與固定
化乙酰膽堿酯酶[11,12]生物傳感器結合, 旨在構建一
種快速檢測有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留的新
方法。
生物傳感器由識別元件、轉(zhuǎn)換元件及檢測元件構
成, 由識別元件承擔特異性識別及反應工作, 之后經(jīng)
換能元件將生化信號轉(zhuǎn)化為可識別的電信號, 以達
到檢測的目的[13,14]。與傳統(tǒng)方法相比, 生物傳感器有
靈敏度高、選擇性好、分析速度快的特點[15]。
2 材料與方法
2.1 儀器與試劑
BPCL 微弱化學發(fā)光儀(中國科學院生物物理所);
HL-2 恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司); 超聲
波清洗器SB-3200DT(寧波新芝生物科技股份公司);
組織搗碎機(PHILIPS); 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀
器廠); AB204-E 電子分析天平(上海天平儀器廠); 722
可見分光光度計(上海欣茂儀器有限公司); HH-4 恒
溫水浴(國貿(mào)電器有限公司); AB204-E 電子分析天平
(上海天平儀器廠); DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪
拌器(武漢科爾儀器設備有限公司)。
碘化硫代乙酰膽堿(ATCI, 純度99%, Sigma 公
司); 電鰻乙酰膽堿酯酶(AChE, Sigma 公司); 殼聚糖
(250g, 脫乙酰度96%, 分子量30 萬, 浙江金殼生物
化學有限公司); 鐵氰化鉀(500g, 純度≥99.0%, 天津
市塘沽區(qū)德華化學試劑); 魯米諾(1g, 純度99%, 美
國Sigma 公司); 解磷定(2-PAM, 25 g,純度99%, 美國
Sigma 公司); 敵敵畏標液(100 μg/mL, 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保
護科研監(jiān)測所研制); 辛硫磷標液(100 μg/mL, 農(nóng)業(yè)
部環(huán)境保護科研監(jiān)測所研制); 樂果標液(100 μg/mL,
農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所研制); 西維因標液(100
μg/mL, 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所研制); 克百威
第12 期 王曉朋, 等: 化學發(fā)光生物傳感器法測定食品中有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留 4165
標液(100 μg/mL, 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所研制);
滅多威標液(100 μg/mL, 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所
研制); 實驗用蔬菜均購自華中農(nóng)業(yè)大學集貿(mào)市場。
2.2 實驗方法
2.2.1 芯片設計
微流控芯片是用于制作芯片的材料單晶硅、無定
形硅、玻璃、金屬和有機聚合物如環(huán)氧樹脂、聚甲基
丙烯酸甲脂(PMMA)、聚碳酸脂(PC)、和聚二甲基硅
氧烷(PDMS)等, 采用微細加工技術在芯片上構建由
微通道、微反應室、儲液池等功能單元構成的微流路
系統(tǒng)[16,17]。高分子聚合物材料種類多, 加工成型方便,
價格便宜, 尤其是高聚物材料有良好的光學性質(zhì)、化
學惰性、電絕緣性和熱性能等, 使其在微流控芯片領
域的應用具有得天獨厚的優(yōu)勢[18]。近年來高聚物為
材料的芯片應用廣泛。
本研究以具有良好的綜合力學性能的高分子聚
合物聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)為原料, 采用銑床刻
蝕法刻蝕微通道。研究采用溶劑鍵合法鍵合芯片, 用
二氯乙烷和異丙醇(1:1, v:v)鍵合, 在顯微鏡下觀察鍵
合效果, 鍵合的微流控芯片平整光滑, 溝道通暢, 無
阻塞現(xiàn)象。且向微通道里注入品紅溶液, 結果溶液在
通道里流動順暢, 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)通道邊沿無滲
漏。微流控芯片如圖1 所示(單位: mm)。
圖1 聚甲基丙烯酸甲酯流通池示意圖
Fig. 1 Schematic diagram of polymethyl methacrylate
flow cell
2.2.2 化學發(fā)光生物傳感器流路設計
傳感器主要包括固定化酶柱和化學發(fā)光儀, 其
他輔助裝置包括蠕動泵、八通閥、及微機等(如圖2)。
a: PBS; b: 碘化硫代膽堿底物溶液; c: 恢復劑2-PAM; d: 樣品; e:
鐵氰化鉀溶液; f: 魯米諾溶液; G 為八通閥; ER: 酶柱; P1、P2: 第1、
2 恒流泵; PMT: 光電倍增管; NHV: 負高壓; W: 廢液; PC: 計算機。
圖 2 化學發(fā)光生物傳感器流路圖
Fig. 2 The flow analysis system of chemiluminescence
biosensor
2.2.3 化學發(fā)光生物傳感器使用流程
首先進行生物傳感器操作條件優(yōu)化, 在最優(yōu)條
件下進行農(nóng)藥濃度檢測。傳感器的具體操作步驟如下:
1) 基線: 調(diào)節(jié)化學發(fā)光儀的負高壓為400 V, 開
啟恒流泵P1、P2, 使pH 為8.0 的磷酸鹽緩沖溶液a、
3 mmol/L 鐵氰化鉀溶液e 和0.6 mmol/L 魯米諾溶液
f 分別通過管道, 直到基線穩(wěn)定, 記錄發(fā)光強度為I;
2) 基礎酶活的測定: 旋轉(zhuǎn)八通閥G, 用0.05
mmol/L 的底物溶液b 替代磷酸鹽緩沖溶液a 通入管
路, 通入時間為70 s, 然后將三通閥重新轉(zhuǎn)回原來的
位置, 停止注入ATCh 的底物溶液, 通入磷酸鹽緩沖
溶液a, 記錄化學發(fā)光強度最低值I0, 即初始酶活;
3) 剩余酶活的測定: 待基線回到原發(fā)光強度后,
停止恒流泵P2, 調(diào)整八通閥, 停止注入磷酸鹽緩沖
溶液a, 通入樣品溶液d, 注入時間為20 min, 然后調(diào)
整八通閥G, 通入磷酸鹽緩沖溶液a, 以去除樣品溶
液。開啟泵P2, 重復步驟2)記錄的化學發(fā)光強度最
低值Ii, 即為剩余酶活性;
4) 酶活恢復: 停止恒流泵P2, 調(diào)整八通閥G,
使?jié)舛葹? mmol/L 恢復劑2-PAM 溶液c 過酶反應器,
持續(xù)15 min, 旋轉(zhuǎn)八通閥, 通入磷酸鹽緩沖溶液a 5
min, 以去除2-PAM 溶液;
5) 復活后的酶活測定: 開啟恒流泵P2, 重復步
驟2)記錄化學發(fā)光最低值Ij, Ij-I 為相對化學發(fā)光強度
值, 選取發(fā)光強度最大, 發(fā)光值波動最小為最佳發(fā)光
條件;
6) 待檢測結束后用清水沖洗管道。
2.2.4 農(nóng)藥的測定
固定化酶的抑制效果用農(nóng)藥樣品溶液通過酶反
應器前后的酶活差值Ii-I0 占基礎酶活I-I0 的百分比表
4166 食品安全質(zhì)量檢測學報 第5 卷
示。其抑制率計算公式如下:
i 0
j 0
(%) 100
I I
I I
―
＝ ×
―
抑制率 (1)
0
(%) j 100 I I
I I
―
＝ ×
―
恢復率
(2)
其中I 為基線化學發(fā)光強度; I0 為未通入農(nóng)藥時
的化學發(fā)光強度; Ii 為通入農(nóng)藥后的化學發(fā)光強度; Ij
為通入恢復劑后的化學發(fā)光強度。
2.2.5 乙酰膽堿酯酶的固定及性能優(yōu)化
根據(jù)文獻[19-21], 并加以改正。首先配制18 mL 濃
度為5%的殼聚糖溶液(2.5％的乙酸溶液), 在錐形瓶
中加入50 mL 液體石蠟, 并加入1.5 mL 分散劑
Span-80, 在一定轉(zhuǎn)速下, 逐滴加入殼聚糖溶液, 繼
續(xù)高速攪拌使溶液液滴分散均勻, 然后逐滴加入0.8
mL 的戊二醛溶液(體積濃度為25%), 40 ℃水浴加熱
交聯(lián)反應lh。反應結束后, 使之與2.5 mol/LNaOH:
無水乙醇(v:v=l:1)溶液混合震蕩, 之后靜置, 去除油
層和水層, 用去離子水多次洗滌到中性, 最后將制得
的微球于4 ℃冰箱存放。
稱取0.500 g 殼聚糖微球加入2.0 mL 濃度為
0.4% GA 溶液充分震蕩15 min, 然后用蒸餾水反復
沖洗以除去多余的戊二醛溶液。稱取0.500 g 經(jīng)活化
后的微球, 加入1.2 U 的酶液, 4 ℃振蕩20 h, 用
PBS( 0.1 mol/L, pH7.5) 沖洗抽濾以除去表面吸附的
游離酶, 在4℃的PBS 中保存?zhèn)溆?。在此條件下測得酶
活回收率為75.35%, 連續(xù)測定6 次, RSD 值為5.76%。
參考Ellman[22]的方法, 并加以改善。移取3
mLPBS 溶液(0.1moL/L , pH=8.0)和0.015 g 固定化酶
于10 mL 比色管中, 混勻。30 ℃水浴30 min 后, 依
次加入100 μL DTNB (20 mmol/L)和20 μL ATCh (100
mmol/L), 混勻, 412 nm 處比色。靜置1min 后迅速讀
出吸光度, 取出比色皿慢慢搖動, 混勻反應體系, 每
隔1 min 讀數(shù), 連續(xù)測定5 min。酶活力(U/g)用每g
酶溶液每1 min 水解底物的μmol 數(shù)表征。
U[μmol/(min·mg)]=V×A/(K×L×m)
式中:
V—反應體系的總體積(mL);
A—吸光度隨時間的變化率(1/min);
L—測定酶活力時溶液的光徑長度, 即比色皿光
程(mm), L=10;
K—消光系數(shù)[L/(mmol·mm)], K=1.36;
m—稱取的固定化酶的質(zhì)量(g)。
2.2.6 酶柱制備
將含有固定化酶的緩沖溶液搖勻, 用膠頭滴管
(酶活力在1 U 左右)吸取酶液, 加到4 cm×4 mm(i.d.)
的短塑料玻璃管中, 玻璃短管兩端拉成1 mm(i.d.)的
尖口。兩端用粘有篩絹(孔徑為0.05 mm)的帶孔橡皮
塞封住, 制得固定化酶柱。
2.2.7 樣品前處理
擦去樣品(包菜、蘋果)表面泥土, 取代表性可食
部分, 用組織搗碎機搗碎, 取樣品5 g, 置于50 mL燒
杯中, 加10 mL 丙酮超聲5 min, 不停振搖, 收集濾液;
然后向燒杯中再加入10 mL 丙酮, 振搖3 min, 合并濾
液, 移入裝有5 g 無水硫酸鈉的玻璃漏斗中, 吹干丙酮,
向離心管中加入10 mL 的磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L、
pH8), 取10 mL 上清液用微孔過濾器過濾后待用。
3 結果與分析
3.1 化學發(fā)光生物傳感器條件優(yōu)化
3.1.1 魯米諾濃度的影響
魯米諾作為發(fā)光劑, 直接影響著化學發(fā)光體系。本
研究考察了濃度為0.2~1.0 mmol/L的魯米諾溶液, 化學
發(fā)光趨勢如圖3 所示: 隨著魯米諾濃度的增大, 相對化
學發(fā)光強度呈增大趨勢。但是噪聲很大, 信噪比降低,
同時濃度為0.6 mmol/L時便可滿足測量所需的發(fā)光值。
綜合考慮以上因素, 選取魯米諾濃度為0.6 mmol/L。
圖3 魯米諾濃度對相對化學發(fā)光強度的影響(n=3)
Fig. 3 The effect of luminol concentrations on relative
chemiluminescence intensity(n=3)
3.1.2 鐵氰化鉀濃度的影響
鐵氰化鉀在堿性條件下可氧化魯米諾產(chǎn)生化學
發(fā)光, 是影響化學發(fā)光體系的重要因素。本研究在
pH 值與魯米諾濃度一定的條件下, 考察了濃度為
第12 期 王曉朋, 等: 化學發(fā)光生物傳感器法測定食品中有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留 4167
1~6 mmol/L 鐵氰化鉀溶液, 化學發(fā)光趨勢如圖所示:
在濃度為3 mmol/L 時達到最大化學發(fā)光值, 故選擇
鐵氰化鉀的濃度為3 mmol/L。
圖4 鐵氰化鉀濃度對相對化學發(fā)光強度的影響(n=3)
Fig. 4 The effect of potassium ferricyanide concentration on
relative chemiluminescence intensity (n=3)
3.1.3 流速的影響
在化學發(fā)光微流動注射體系中, 試劑混合和反
應速度迅速, 因此必須選擇合適的流速, 保證試劑能
夠充分混合并能獲得較高的化學發(fā)光強度。流速太快
樣品來不及混合反應, 不能有效地采集反應信號, 并
且流路壓力過大, 易造成管路泄露; 流速太慢不易形
成連續(xù)的流體。
本研究考察了0.20~0.45 mL/min 的流速情況下
的發(fā)光趨勢, 如圖5 所示: 隨著流速的增大, 相對化
學發(fā)光強度不斷增大, 基線達到平衡的時間逐漸延
長。但是隨著流速的增加, 化學發(fā)光的值波動較大,
泵壓也相應增加。綜合考慮達到平衡所需時間, 以及
實驗所需發(fā)光強度, 選擇流速為0.40 mL/min。
圖5 恒流泵流速對相對化學發(fā)光強的的影響(n=3)
Fig. 5 The effect of constant-flow pump speed on relative
chemiluminescence intensity(n=3)
3.1.4 底物濃度的影響
底物硫代乙酰膽堿對化學發(fā)光強度影響很大。本
實驗考察了0~100 mmol/L 濃度條件下底物對化學發(fā)
光強度的影響。結果如圖6 所示, 底物濃度在0~20
mmol/L 范圍內(nèi), 化學發(fā)光強度隨著底物濃度的增加而
急劇上升; 而當?shù)孜餄舛却笥?0 mmol/L 后, 吸光度積
分值趨于平緩。所以選擇底物最佳濃度為20 mmol/L。
圖6 底物濃度對化學發(fā)光強度變化值的影響(n=3)
Fig. 6 The effect of substrate concentration on
chemiluminescence intensity(n=3)
3.1.5 底物與酶接觸時間的影響
在一定范圍內(nèi), 底物與酶作用的時間越長, 生
物傳感器顯示化學發(fā)光強度變化越明顯。但由于有機
磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是底物競爭性抑制劑, 將影
響農(nóng)藥對酶抑制程度的準確性。
本實驗研究了底物濃度為20 mmol/L 時與酶作
用20~120 s 時間范圍內(nèi)對化學發(fā)光強度的影響。從
圖7 所示, 作用時間在20~100 s 范圍內(nèi), 化學發(fā)光值
逐漸增強, 當超過70 s 后, 化學發(fā)光強度變化緩慢,
并且化學發(fā)光積分值峰形變得鈍和寬, 出現(xiàn)拖尾現(xiàn)
象。所以選擇最佳的酶與底物的接觸時間為70 s 作
為后續(xù)的研究。
3.1.6 農(nóng)藥抑制時間的影響
乙酰膽堿酯酶與有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的
反應, 類似于酶與底物的反應。首先二者形成酶-農(nóng)
藥復合物, 隨后農(nóng)藥的酰基轉(zhuǎn)移到酶活性中心絲氨
酸上的羥基使酶喪失活性, 從而使酶-受到抑制。農(nóng)
藥對乙酰膽堿酯酶的抑制時間不同, 生物傳感器的
響應值變化也不同。
本研究選用1 μg/mL 的敵敵畏標準溶液考察了
4168 食品安全質(zhì)量檢測學報 第5 卷
5~30 min 抑制時間內(nèi), 生物傳感器響應值的變化, 趨
勢圖如圖8 所示: 在5~20 min 時間范圍內(nèi), 隨著農(nóng)藥
與酶反應器接觸時間的延長, 酶活受抑制的程度不
斷增強, 當抑制時間大于20 min 時, 酶活抑制率雖
然還有上升趨勢, 但是變化幅度較小。因此, 本研究
最終選擇20 min 作為農(nóng)藥抑制時間。
圖7 底物與酶接觸時間對化學發(fā)光強度變化值的影響(n=3)
Fig. 7 The effect of substrate contacting time on
chemiluminescence intensity (n=3)
圖8 農(nóng)藥抑制時間對酶活力的影響(n=3)
Fig. 8 The effect of inhibition time on inhibition rate(n=3)
3.1.7 恢復時間的影響
有報道[23]發(fā)現(xiàn)3 種肟類化合物對辛硫磷抑制乙
酰膽堿酯酶具有重活化作用。目前常用的重活化劑多
為肟類化合物, 如氯磷定、雙復磷、甲磺磷定、雙磷
定等。本研究區(qū)采用碘解磷定(2-PAM)作為乙酰膽堿
酯酶的復活劑, 選用1 μg/mL 的敵敵畏溶液作用酶反
應器20 min 后, 研究1 mmol/L 2-PAM 對酶活恢復的
最佳時間。研究考察了5~30 min 恢復時間對傳感器
化學發(fā)光強度的影響, 結果如圖9 所示: 當2-PAM溶
液的作用時間等于或大于15 min 時, 受到抑制的固定
化酶的活力可以恢復到初始酶活的87%以上, 延長恢
復時間可以更好地恢復酶活, 但綜合考慮檢測時間和
恢復率等因素, 確定恢復時間為15 min 比較合適。
圖9 恢復時間對酶活恢復率的影響(n=3)
Fig. 9 The effect of recovery time on recovery rate(n=3)
3.2 標準曲線的建立
分別配制濃度為0.1~10 μg/mL 的辛硫磷標準溶
液, 濃度為0.08~10 μg/mL的敵敵畏標準溶液, 濃度為
0.8~15 μg/mL 的樂果標準溶液, 濃度為0.08~15 μg/mL
的克百威標準溶液, 濃度為0.1~10 μg/mL 西維因標準
溶液, 濃度為0.1~10 μg/mL 的滅多威標準溶液。
在最佳條件下測定化學發(fā)光值, 取農(nóng)藥的對數(shù)
濃度(μg/mL)為橫坐標, 酶活抑制率(%)為縱坐標, 做
線性回歸方程, 并計算線性相關系數(shù); 以酶活抑制率
為5%作為檢出限, 結果如表1 所示。
3.3 精密度實驗
在最佳條件下對含有辛硫磷、敵敵畏、樂果、克
百威、西維因、滅多威的溶液分別測定6 次, 如表2
所示, 其RSD 均小于7%, 可見所研制的傳感器具有
較好的精密度。
3.4 穩(wěn)定性實驗
在沒有農(nóng)藥抑制的條件下, 向傳感器連續(xù)6 次流
動注射底物ATCh (0.05 mmol/L, 40 s), 所得到的峰值
見圖10。由圖可知, 雖然傳感器的基線隨著注射次數(shù)
第12 期 王曉朋, 等: 化學發(fā)光生物傳感器法測定食品中有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留 4169
的增加而產(chǎn)生一定的漂移, 但是傳感器對底物的響
應較好(RSD=7.75%, n=6), 表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。
3.5 酶柱保存穩(wěn)定性
將固定化酶保存在4 ℃, 含0.02% NaN3、濃度
為0.1 mol/L, pH=8.0 的磷酸鹽緩沖液中, 每10 d 測定
一次化學發(fā)光值, 持續(xù)兩個月, 結果見圖11。固定化
酶的活力在整個保存期內(nèi)(60 d)稍有下降, 與原酶活
相比, 2 個月內(nèi)僅降低了23%。
3.6 樣品檢測及添加回收率
取包菜、蘋果樣品各三份, 分為三組, 分別向包
菜樣品中添加不同量的辛硫磷標品, 分別為加標前
辛硫磷含量的80%、100%、120%; 向蘋果樣品中添
表1 農(nóng)藥的線性相關方程、相關系數(shù)與檢出限
Table 1 Regression equation, correlation coefficient and limit of detection of pesticides
種類 線性范圍(μg/mL) 線性方程 相關系數(shù)(R²) 檢出限(μg/mL)
辛硫磷 0.1~10 Y = 10.366X + 18.995 0.9923 0.047
敵敵畏 0.08~10 Y = 16.22X + 25.614 0.9903 0.054
樂果 0.8~15 Y = 7.2755X + 8.0116 0.9904 0.388
克百威 0.08~15 Y = 19.843X + 31.059 0.9926 0.049
西維因 0.1~10 Y = 16.22X + 25.614 0.9972 0.051
滅多威 0.1~10 Y = 12.001X + 18.182 0.9944 0.080
表2 精密度實驗結果
Table 2 The results of precision experiment
農(nóng)藥
檢測次數(shù)(μg/mL) RSD值(%)
1 2 3 4 5 6
辛硫磷 1.982 2.071 2.032 2.206 2.301 1.871 6.897
敵敵畏 1.117 1.172 1.093 1.106 1.038 1.002 5.539
樂果 2.212 2.082 2.193 1.926 2.036 2.124 4.628
克百威 1.024 1.041 1.074 1.176 1.137 1.021 5.435
西維因 1.087 1.106 1.171 1.038 0.965 1.026 6.577
滅多威 1.106 1.047 1.175 1.098 1.037 1.041 4.520
圖10 多次注射底物ATCh 后傳感器的響應值
Fig. 10 Responses of the biosensor to repeated injection of ATCh
圖11 傳感器化學發(fā)光強度隨時間的變化(n=3)
Fig. 11 The stability of microfluidic biosensor(n=3)
4170 食品安全質(zhì)量檢測學報 第5 卷
表3 農(nóng)藥在包菜、蘋果中的添加回收率與相對標準偏差
Table3 Pesticides recoveries and relative standard deviation in cabbage, apple
樣品 農(nóng)藥種類 加標前量±SD 值 (μg/g) 加標量 (μg/g) 期望值 (μg/g) 測量值±SD 值 (μg/g) 回收率±SD (n=3)
包菜 辛硫磷
1.297±0.04 1.000 2.297 2.194±0.101 0.900±0.084
1.297±0.04 1.300 2.597 2.477±0.104 0.909±0.083
1.297±0.04 1.560 2.857 2.743±0.115 0.929±0.072
蘋果 西維因
2.31±0.066 1.800 4.110 4.071±0.049 0.982±0.033
2.31±0.066 2.260 4.570 4.512±0.154 0.977±0.073
2.31±0.066 2.600 4.910 4.827±0.093 0.971±0.036
加不同量的西維因標品, 分別為加標前含量的80%、
100%、120%, 1 h 后按2.2.7 方法處理, 用所建立的生
物傳感器在最優(yōu)測定條件下進行測定。選用辛硫磷標
準曲線對包菜中的辛硫磷含量與加標回收率進行計
算, 選用西維因標準曲線對蘋果中的西維因含量與
加標回收率進行計算, 結果如表3 所示, 可以看出各
個樣品回收率均大于90%, 在90%~99%之間, 平均
偏差≤8.5%, 具有較好的回收率, 表明此方法對檢
測包菜、蘋果中的有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢
測結果較為準確。
4 結 論
本研究構建了微流控芯片與固定化酶柱結合的
化學發(fā)光生物傳感器法測定有機磷與氨基甲酸酯農(nóng)
藥殘留的新方法。同時建立了辛硫磷、敵敵畏、樂果、
克百威、西維因、滅多威的標準曲線。當農(nóng)藥殘留濃
度在一定范圍內(nèi)時, 化學發(fā)光值與農(nóng)藥對數(shù)濃度有
良好的線性關系(R²>0.99), 辛硫磷檢測范圍為
0.1~10 μg/mL, 檢出限為0.047 μg/mL; 敵敵畏檢測
范圍為0.08~10 μg/mL, 檢出限為0.054 μg/mL; 樂果
檢測范圍為0.8~15 μg/mL, 檢出限為0.388 μg/mL;
克百威檢測范圍為0.08~15 μg/mL, 檢出限為0.049
μg/mL; 西維因檢測范圍為0.1~10 μg/mL, 檢出限為
0.051 μg/mL; 滅多威檢測范圍為0.1~10 μg/mL, 檢
出限為0.080 μg/mL, 研究擴大了檢測的線性范圍,
為農(nóng)藥殘留的檢測提供了一種新思路。
同時, 本研究對傳感器的性能進行了評價, 測試
指標有精密度、穩(wěn)定性、加標回收率、酶柱保存活性
等。實驗證明, 此生物傳感器有著良好的性能, 適用
于農(nóng)藥殘留的快速分析, 具有操作簡單、效率高、工
作量小的特點。此外該方法檢出限小于我國相關標準
規(guī)定的蔬菜、水果中農(nóng)藥最高殘留限量(MRL)值(0.2
mg/kg 和0.5 mg/kg)的要求, 因此本法完全滿足對蔬
菜、水果中有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的分析。
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(責任編輯: 楊翠娜)
作者簡介
王曉朋, 本科, 主要研究方向為食品
科學與工程。
E-mail: 937530451@qq.com
劉曉宇, 博士, 教授, 博士生導師,
主要研究方向為食品安全與農(nóng)業(yè)資源綜合
利用。

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