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黃曲霉毒素危害和檢測方法研究進(jìn)展

文檔作者：羅自生 1*, 徐艷群1, 秦雨 1, 樓錫錦1, 何良興2, 徐庭巧2, 魏云瀟2 ( , 文檔來源： 1. 浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系 2. 杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測中心		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時間： 2025年06月24日
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第4 卷第 6 期食 品安全質(zhì)量檢測學(xué)報Vol. 4 No. 6
2013 年12 月Journal of Food Safety and Quality Dec. , 2013
基金項(xiàng)目: 浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督系統(tǒng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(20120238)、浙江省杰出青年項(xiàng)目 (LR13C200001) 和浙江省科技項(xiàng)目(2011C35022)
Fund: Supported by Zhejiang Provincial Quality and Technical Supervision System of Scientific Research Project(20120238), Zhejiang
Provincial Natural Science Foundation(LR13C200001) and Zhejiang Province Science and Technology Project(2011C35022)
*通訊作者: 羅自生, 教授/系主任, 主要研究方向?yàn)槭称繁ｕr生物學(xué)。E-mail: luozsiheng@zju.edu.cn
*Corresponding author: LUO Zi-Sheng, Professor, Department of Food Science and Nutrition, Fuli Institute of Food Science, Zhejiang University,
No.866, Yuhangtang Road, Xihu District, Hangzhou 310058, China. E-mail: luozsiheng@zju.edu.cn
黃曲霉毒素危害和檢測方法研究進(jìn)展
羅自生 1*, 徐艷群1, 秦雨 1, 樓錫錦1, 何良興2, 徐庭巧2, 魏云瀟2
(1. 浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系, 杭州 310058; 2. 杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測中心, 杭州 311119)
摘要: 黃曲霉毒素具有致癌性和致畸性, 即使痕量級水平的攝入也會對人體健康產(chǎn)生長時間的危害。糧食等作
物在生長和貯存期間都可被黃曲霉毒素污染。由于其高毒性, 已有很多檢測方法來檢測不同樣品中黃曲霉毒素的
含量, 這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn), 且并不是每個方法都能滿足國標(biāo)限量水平。本文綜述了不同黃曲霉毒素對人體的危
害, 分析檢測技術(shù)的發(fā)展, 重點(diǎn)討論幾種較成熟方法在不同基質(zhì)中的應(yīng)用。
關(guān)鍵詞: 黃曲霉毒素; 危害; 分離; 檢測
The hazards and detection methods of aflatoxins
LUO Zi-Sheng1*, XU Yan-Qun1, QIN Yu1, LOU Xi-Jin1, HE Liang-Xing2,
XU Ting-Qiao2, WEI Yun-Xiao2
(1. College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;
2. The Center of Yuhang Agricultural Products Detection, Hangzhou 311119, China)
ABSTRACT: Aflatoxins are mutagenic and carcinogenic. Even if people eat it at tract level, people’s health
will be harmed for a long time. The foodstuffs would be contaminated by aflatoxins during growing and storing
periods. Due to the high toxicity, sensitive determination techniques for analyzing the aflatoxins of different
samples are developed. Each technique has some advantages and disadvantages and not all of them can test at
limited level. This review aims to summarize the different health effects of aflatoxins for people, the development
of analytical techniques and special discussion about the applications of developed techniques in a variety
of matrices.
KEY WORDS: aflatoxin; hazards; separation; detection
黃曲霉毒素(aflatoxin, AF)作為一種重要的真菌
毒素, 主要是黃曲霉和寄生曲霉等真菌的次生代謝
產(chǎn)物, 目前已發(fā)現(xiàn)約20 種, 包括B1、B2、G1、G2、
M1、M2、P1、Q1、B2、GM 和毒醇等, 其中前六種最
常見。黃曲霉毒素存在于多種食物中, 包括油料、谷
物、堅(jiān)果、調(diào)味料及牛奶等。植物性食物和飼料中的
AFB1、AFB2、AFG1 和AFG2 是由霉菌污染后直接產(chǎn)
生。AFM1 和AFM2 是哺乳動物食用了黃曲霉毒素污
染的飼料所產(chǎn)生的耐熱性羥化代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素
具有致癌性、肝毒性、致畸性和致突變, 人和動物體
主要通過膳食渠道攝入[1], 對公眾健康有很大的威脅,
1993 年被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,
WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research
on Cancer, IARC)列為I 類致癌物質(zhì)[2]。我國最
1664 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報第 4 卷
新修訂的 GB 2761-2011 對各類食品中的黃曲霉毒素
B1 和M1 的限量進(jìn)行了規(guī)定。黃曲霉毒素的檢測方法
要滿足相應(yīng)的限量要求, 評價和借鑒國際上的現(xiàn)有
方法十分必要。本文詳細(xì)闡述了黃曲霉毒素的危害及
限量, 從樣品前處理、分離檢測兩方面對現(xiàn)有檢測方
法進(jìn)行了綜述, 討論了各方法的優(yōu)、缺點(diǎn), 為新限量
要求下的方法選擇提供依據(jù)。
1 黃曲霉毒素的危害和限量
在真菌毒素中, 黃曲霉毒素是最受關(guān)注的種
類之一, 因?yàn)樗粌H帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失而且對
人類健康有很大威脅[3,4]。糧食在生長、收獲和最
后貯存過程中都可能被黃曲霉毒素污染[5]。黃曲霉
毒素對人類和動物都是高毒性化合物。其中, AFB1
是食品樣品中常見的一種, 研究表明它的致癌性
和毒性最強(qiáng)。
動物實(shí)驗(yàn)證明, 黃曲霉會嚴(yán)重影響動物生長發(fā)
育[6]。家禽實(shí)驗(yàn)表明, 急、慢性黃曲霉毒素中毒導(dǎo)致
肉/蛋產(chǎn)量下降、免疫抑制和肝毒中毒[7]。此外, AFB1
影響雞胚胎發(fā)育并增加死亡率。人類黃曲霉毒素中毒
根據(jù)接觸水平產(chǎn)生不同的危害, 高劑量會導(dǎo)致快速
死亡, 慢性中毒則引發(fā)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,
HCC)等。HCC 是我國、東南亞和撒哈拉以
南非洲許多地區(qū)最常見的癌癥。在這些地區(qū), 高達(dá)
10%的成人死亡與HCC 有關(guān)。AFB1 可與B 或C 型
病毒性肝炎協(xié)同作用導(dǎo)致HCC。HCC 導(dǎo)致一種肝癌,
肝臟是AFB1 主要的靶器官[8]。兒童生長受損是黃曲
霉毒素中毒的又一危害。研究表明兒童在結(jié)束母乳喂
養(yǎng)后攝入黃曲霉毒素含量高的食物后生長變慢[9]。母
體的新陳代謝限制了膳食中的黃曲霉毒素轉(zhuǎn)移到母
乳中。嬰幼兒接觸黃曲霉毒素的量可以通過血液中的
黃曲霉毒素-白蛋白(aflatoxin-albumin, AF-alb)加合物
測定。Wild 等[10]人在懷孕的岡比亞女性的臍帶血中
發(fā)現(xiàn)了AF-alb 加合物, 認(rèn)為是由于黃曲霉毒素的親
脂性, 它們可以很容易的穿過胎盤屏障。黃曲霉毒素
的另一個危害是對人體免疫系統(tǒng)的損害[11]。黃曲霉毒
素表現(xiàn)出免疫抑制效應(yīng), 它通過不同機(jī)制抑制了
DNA、RNA 和蛋白合成[12]。Turner 等[13]對岡比亞接
觸了黃曲霉毒素的兒童進(jìn)行了研究, 探究體內(nèi)抗體
反應(yīng), 發(fā)現(xiàn)這些兒童唾液中免疫球蛋白A(secreted
immunoglobulin A, slgA)水平明顯下降。slgA 綁定細(xì)
菌和病毒表面的抗原, 在唾液、乳汁、眼淚和支氣管、
生殖-泌尿和消化道粘液中形成部分粘膜屏障。slgA
的減少導(dǎo)致腸道抗菌能力下降。其他霉菌毒素如赭曲
霉毒素和伏馬毒素可與AFB1 協(xié)同影響免疫系統(tǒng)[13]。
總結(jié)來說, AFB1不僅對肝臟有影響, 對其他器官和系
統(tǒng), 如肺和免疫系統(tǒng), 也產(chǎn)生了不同的危害[14]。
考慮到黃曲霉毒素對健康危害的嚴(yán)重性, 限定
其最大攝入量的法律法規(guī)正在逐步確立。聯(lián)合國糧食
與農(nóng)業(yè)組織(Food &amp;amp; Agriculture Organization of the
United Nations, FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定人
類食品中的黃曲霉限量是30 μg/kg[15]。隨后, 2002 年
歐盟規(guī)定黃曲霉毒素總量和AFB1 的最高安全水平分
別為4 μg/kg 和2 μg/kg[16]。另外, 食品規(guī)范委員會規(guī)
定了花生中黃曲霉毒素總量限量為15 μg/kg[17]?？紤]
到這些限量規(guī)定, 許多國家建立了自己相關(guān)的法律
法規(guī)。我國也給出了自己的限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2011,
對各類食品中的B1 和M1 的含量進(jìn)行了限定, 其中最
低限量達(dá)0.5 μg/kg。
2 黃曲霉毒素的檢測
2.1 黃曲霉毒素的提取
為了更加深入了解食品中黃曲霉毒素的毒性,
對于其各不同化學(xué)形態(tài)的檢測都要在可測水平上進(jìn)
行。黃曲霉毒素的測定有三個步驟至關(guān)重要, 即提
取、分離和檢測。其中提取是測定中最關(guān)鍵的一步。
在這一步中, 要在不發(fā)生任何改變的前提下, 提取
分析基質(zhì)中的所有需要測定的物質(zhì)。提取工藝的效
率跟樣品基質(zhì)有很大關(guān)系。因此, 很有必要建立一
套可從不同基質(zhì)中有效提取所有黃曲霉毒素的提取
方法。
目前效果較好的提取方法包括: 混合溶劑液液
萃取、固相萃取、固相微萃取、PH 調(diào)控的溶劑萃取、
免疫親和柱(同時進(jìn)行凈化和提取)等。一般采用一定
比例的甲醇/水或乙腈/水溶液作為提取溶劑, 通過機(jī)
械振蕩、均質(zhì)、超聲等手段進(jìn)行提取。在提取溶液中
加入溴化鉀溶液可以增強(qiáng)提取效果, Sheijooni 等[18]
使用均勻的液液萃取法提取大米和谷物樣品中的
AFB1。此方法中, 5 g 磨好的樣品中加入10 mL 甲醇/
水(8:10, v/v), 400 r/min 機(jī)械振蕩30 min。體系中加入
6 mL 3%溴化鉀水溶液來獲得濁液, 從而使提取溶劑
更好的分散在水相中。而一些新型的提取方法為檢測
提供了更多實(shí)用、可靠的選擇。Aguilera 等[19]在超高
第6 期羅自生, 等: 黃曲霉毒素危害和檢測方法研究進(jìn)展 1665
壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra high pressure liquid chromatography
tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS)
法同時測定牛奶中真菌毒素和農(nóng)藥殘留實(shí)驗(yàn)中比較
了不同提取過程, 包括固相萃取、“dilute-andshoot”(
基于液液萃取的一種提取過程)以及基于
QuEChERS(快速、方便、廉價、有效、穩(wěn)定和安全)
的方法。這些方法的回收率在60%~120%范圍內(nèi), 相
對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于25%。pH 調(diào)控溶劑萃取法是另一種
高效新型提取方法, Santini 等[20]采用該方法檢測人類
血清中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 以及他們的代謝
產(chǎn)物AFM1 和AFM2, 使用pH 調(diào)控乙酸乙酯萃取從
人類血清中提取黃曲霉毒素, 各回收率在31%~98%
之間, 該方法樣品消耗少(只需500 μL)、無需凈化。
選擇合適的溶劑可以實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素與其他毒素的
同時提取, Grio 等[21]采用丙烯腈/水(80:20, v/v)超聲提
取, 通過C18 柱凈化處理, HPLC-MS/MS 法來測定動
物飼料中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 和赭曲霉毒
素A, 回收率在84%~113%之間, RSD 很低(小于
20%)。固相微萃取的自動化使得其應(yīng)用更廣泛,
Nonaka 等[22]運(yùn)用自動在線管式固相微萃取配合
LC-MS/MS 來檢測堅(jiān)果、谷物、干果和香料中的黃
曲霉毒素(B1、B2、G1、G2), 堅(jiān)果和谷物中的加標(biāo)回
收率達(dá)到80%以上, RSD 小于11.2%。此外, 二次提
取也可明顯提高復(fù)雜基質(zhì)的檢測效率, Vega[23]分析
了花生醬樣品中黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)的含
量。待測物先用15%氯化鈉的甲醇(7:3, v/v)溶液提
取, 再用甲醇進(jìn)行二次提取。柔滑花生醬中B1、B2、
G1、G2 的回收率分別是95.2%、89.9%、94.1%和
62.4%, 而脆花生醬中的回收率分別是92.4% 、
84.3%、85.5%和53.7%。免疫親和柱由于高特異性
而在黃曲霉毒素提取凈化中廣泛使用。Tabari 等[24]
采用免疫親和柱提取凈化-高效液相法來測定酸奶
中的AFM1, 三天的平均回收率為72.57%~86.66%,
RSD 在2.56%~8.41%內(nèi), 日間和組間平均回收率為
80%; Roussi 等[25]也采用免疫親和柱提取凈化法對
希臘商業(yè)化的生牛奶和市場牛奶中的AFM1 進(jìn)行了
檢測。
2.2 黃曲霉毒素的分離和檢測
現(xiàn)行黃曲霉毒素檢測方法從原理上主要有薄層
層析法(TLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高壓液相色譜(串
聯(lián)不同檢測器)三大類。
2.2.1 高壓液相色譜(HPLC)
HPLC 由于其分離能力強(qiáng)、靈敏度高和再現(xiàn)性
好、使用方便、易于自動化以及能夠配合不同的檢
測器等諸多優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用[26]。正相和反相色譜都
能夠用于黃曲霉毒素檢測, 但反相色譜因其整體優(yōu)
勢而被更多的使用[27]。反相分離大多采用C18 柱, 水
-乙腈-甲醇按適當(dāng)比例配制流動相。某項(xiàng)測定花生
中AFB1 研究證明乙腈-水的流動相中不加入甲醇也
是可行的[17]。Tarin 等[28]使用水-乙腈-甲醇(60:25:15,
v/v/v)組成的流動相等梯度洗脫, 能夠在12 min 內(nèi)分
離黃曲霉毒素B1、B2、G1 和G2。Khayoon 等[29]報
道, 使用水分含量大于70%的流動相會降低分析靈
敏度。
檢測器中熒光檢測器是最流行的一類[30,31]。
AFB2 和AFG2 由于含氧高共軛結(jié)構(gòu)是強(qiáng)熒光分子,
而AFB1 和AFG1 則是弱熒光分子, 因此很多研究采
用柱前衍生法來增強(qiáng)其熒光而提高檢測靈敏度。
Dall’asta 等[32]研究了原生和取代環(huán)糊精(CD)衍生物
對黃曲霉毒素B1、B2、G1 和G2 熒光強(qiáng)度的影響。他
們發(fā)現(xiàn), 琥珀酰-β-CD 的存在( 摩爾比AF:
CD=1.0×106 )能將黃曲霉毒素B1 和G1 的熒光強(qiáng)度分
別增強(qiáng)63 倍和53.9 倍, 但對于高熒光的B2 和G2 分
子增強(qiáng)倍數(shù)不超過2.3。三氯乙酸(TFA)是另一廣泛應(yīng)
用的熒光增強(qiáng)試劑, 它將B1 和G1 轉(zhuǎn)化為他們相應(yīng)的
半縮醛衍生物B2A和G2A, B2和G2不受影響。因 TFA
是一種有毒和腐蝕性的化學(xué)物質(zhì)而在化學(xué)分析中不
是首選。但Khayoon 等[29]在研究中使用TFA 溶液與
正己烷混合進(jìn)行柱前衍生取得了較好的結(jié)果, 四種
黃曲霉毒素的響應(yīng)值較高。光化學(xué)衍生是一種新的衍
生方法。該方法中, HPLC 與可透過紫外光的聚四氟
乙烯管相連, 管子外面包裹著高強(qiáng)度的紫外發(fā)生器
[33]。紫外光照射使水產(chǎn)生羥基自由基, 這些自由基與
B1 族和G1 族黃曲霉毒素反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的高熒光化合
物[34]。這種方法與化學(xué)衍生相比有幾個優(yōu)點(diǎn): 簡單、
快速、不需要額外的化學(xué)試劑、泵和加熱器[34]。近
幾年, Gnonlonfn 等[35]在黃曲霉測定實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)成功
應(yīng)用了該衍生方法。Waters 公司針對 UPLC 系統(tǒng)檢
測黃曲霉毒素而開發(fā)出大體積流動池直接檢測。大體
積流動池直接檢測原理與光化學(xué)柱后衍生相似, 但
無需進(jìn)行柱前或者柱后衍生。由于省去了柱后衍生裝
置, 分離后直接進(jìn)入流動池檢測, 大大減少了長管路
1666 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報第 4 卷
導(dǎo)致的死體積, 有助于改善峰型。王軍淋等[36]研究表
明, 相同濃度下, 各黃曲霉毒素采用大流動池直接檢
測的峰面積較光化學(xué)衍生后要大, 有助于降低定量
時的誤差。
質(zhì)譜檢測器(MS/MS)在最近幾年得到了很大的
關(guān)注[37,38]。它提供了化合物的結(jié)構(gòu)信息并實(shí)現(xiàn)了超痕
量檢測。它還實(shí)現(xiàn)了同一實(shí)驗(yàn)同時測定多種真菌毒素
[39]。Cavaliere 等[39]研究了電噴霧電離(ESI)和大氣壓
光致電離(APPI)技術(shù)在測定AFM1 上的適用性。根據(jù)
研究結(jié)果, APPI 相比于ESI 在靈敏性上要好2 倍。這
種檢測器通常會有普通電離、基質(zhì)效應(yīng)以及重現(xiàn)性不
好的問題, Cervino 等[40]運(yùn)用同位素標(biāo)記法克服了這
些困難。同位素內(nèi)標(biāo)法具有很好的應(yīng)用前景, 現(xiàn)在
LC-MS/MS 一般都采用該方法。
另有其他幾種檢測器用于黃曲霉毒素定量研究,
如電化學(xué)檢測器等。Elizalde 等[41]建立了一種通過測
定電流來檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1 和G2 的方法。
AFG1 被發(fā)現(xiàn)是最具有電活性的。另有研究將溶出伏
安法成功應(yīng)用在測定落花生樣品中的AFB1 和
AFB2
[42]。
2.2.2 薄層色譜(TLC)
雖然薄層色譜因靈敏度低和重現(xiàn)性不好而大量
被HPLC以及其他檢測黃曲霉毒素的技術(shù)所取代, 但
仍然廣泛使用[43]。TLC 是一種快速、實(shí)用、定量或
半定量檢測各種基質(zhì)中黃曲霉毒素的方法?？梢院唵?
估計(jì)污染水平, 主要優(yōu)勢是在短時間內(nèi)快速分析多
種樣品, 單樣品分析成本低[43]。通過主要的分離點(diǎn)暴
露在紫外光下測定熒光強(qiáng)度[44]或吸光度[45]來定量,
另一種半定量的方法是通過比較提取的黃曲霉毒素
與標(biāo)準(zhǔn)的斑點(diǎn)的尺寸[46]。該方法的可靠性很大程度
上依賴于操作經(jīng)驗(yàn)。加壓薄層色譜, 也叫做高壓薄層
色譜(HPTLC), 串聯(lián)光密度測定增加了該方法的受
歡迎度。但隨著各種更加可靠方法的發(fā)展, TLC 更多
的被HPLC 和酶聯(lián)免疫法取代。
表 1 歸納了常見的幾種黃曲霉毒素的分離和檢
測方法。當(dāng)使用高壓液相色-熒光檢測法(high performance
liquid chromatography-fluorescence detection,
HPLC-FD)時, 可以在μg/kg 水平下檢測AFB1、AFB2、
AFG1 和AFG2。雖然用乙腈:水(9:1, v/v)洗脫、固相萃
取后的回收率在71.4%~93%之間, 但使用ODS 柱的
HPLC-FD 法比用C18 柱具有更高的靈敏度。另外, 不
論是使用ODS 柱或者C18 柱, HPLC-FD 技術(shù)相比于
液相色譜-二極管陣列檢測器(liquid chromatography-
photodiode array detector, LC-DAD)技術(shù)都明顯
具有更低的檢出限。HPLC-FD 的檢出限是μg/kg 水
平而LC-DAD 是mg/kg。串聯(lián)質(zhì)譜體系具有更高的靈
敏度, 它們是最近使用最多的檢測手段。LC-MS/MS
法的靈敏度高, 但當(dāng)考慮到回收率時, HPLC-FD法比
較好。最后, 關(guān)于AFM1 的檢測, 二維TLC 法具有較
高靈敏度, 但它的萃取回收率最高只有89.5%。
2.2.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)
ELISA 是一種基于免疫反應(yīng)的檢測方法。ELISA
法快速、靈敏, 最大可能減少了樣品凈化量, 適用于
數(shù)量多和取樣量少的樣品分析[55]。雖然ELISA 法的
局限性比黃曲霉毒素的儀器分析法低, 但基質(zhì)效應(yīng)
是其一個顯著的問題, 這影響了測定結(jié)果的可靠性
[56]。當(dāng)與TLC 和HPLC 技術(shù)相比較時, ELISA 可能
因?yàn)榛|(zhì)效應(yīng)而產(chǎn)生假陽性。在某項(xiàng)研究中, 相同的
樣品分別用ELISA 和HPLC 技術(shù)進(jìn)行分析, ELISA 測
定的結(jié)果比HPLC 測定的要高[57]。ELISA 的這個缺
點(diǎn)使得它只能用于一些基質(zhì)影響小的樣品[58]。ELISA
中的目標(biāo)分析化合物是某種黃曲霉毒素不是所有抗
原, 具有類結(jié)構(gòu)的其他黃曲霉毒素也會與抗體結(jié)合,
從而產(chǎn)生了干擾[59]?，F(xiàn)在市場上有相應(yīng)的一次性商
業(yè)檢測試劑盒, 被廣泛用于黃曲霉毒素水平的實(shí)際
監(jiān)測[60]。試劑盒包括黃曲霉毒素的單克隆或多克隆
抗體[61]。它的工作原理很簡單: 一系列的抗體固定在
特殊的板或柱上, 當(dāng)板或柱與黃曲霉毒素接觸時, 樣
品中黃曲霉毒素的表位被抗體識別進(jìn)而形成復(fù)合物。
然后形成的復(fù)合物與產(chǎn)色底物反應(yīng), 產(chǎn)生電信號、光
信號或其他可測信號[43]。抗體的質(zhì)量和穩(wěn)定性是高
性能免疫分析的重要影響因素, 長時間的存放中要
確保相關(guān)試劑的穩(wěn)定性。可通過對酶蛋白結(jié)構(gòu)的直接
位點(diǎn)誘變、固定到固定相、化學(xué)修飾或添加穩(wěn)定劑 [56]
來增加其穩(wěn)定性。
2.2.4 快速檢測方法
隨著食品行業(yè)的發(fā)展和食品安全問題的日益突
出, 需要監(jiān)控的食品種類和數(shù)量不斷增加, 對檢測效
率的要求越來越高, 產(chǎn)生了很多快速檢測放法, 包括:
膠體金免疫層析法、時間分辨熒光免疫分析法、電化
學(xué)傳感器檢測法等。膠體金免疫層析法(gold immunochromatography
assay, GICA)是20 世紀(jì)80 年代發(fā)
展起來的一種膠體金免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)
合的固相膜免疫分析技, 可在5~10 min 中完成對樣
第6 期羅自生, 等: 黃曲霉毒素危害和檢測方法研究進(jìn)展 1667
表1 常見的幾種黃曲霉毒素的分離和檢測方法
Table 1 Some common seperating and detecting methods for aflatoxins
方法基質(zhì) 分析物 提取 色譜條件 LOD 回收率
參考
文獻(xiàn)
LC-DAD 開心果B1, B2,
G1, G2
用含有 0.75 g NaCl 的
甲醇/水/己烷,(4/1/1.7, v/v/v)
分離提取;
然后采用C18 固相萃取柱凈化
柱子: ODS
流動相:線性
梯度起點(diǎn): 甲醇: 水: 乙腈
10:60:30 (v/v/v)
LOD (mg/kg)
B1, 2.12
B2, 1.24
G1, 2.26
G2, 2.63
73%~
115% [47]
HPLC-FD
人工污染的
食物
B1, B2,
G1, G2
用甲醇/水(70/30, v/v)
分離提取; 然后采用
Aflatest-P 親和柱凈化
柱子: C18
流動相: 水: 甲醇: 乙腈
60:25:15(v/v/v)
LOD (μg/kg)
每一個都為1
80%~
110% [48]
HPLC-FD
虹鱒魚的
肌肉和
肝臟
B1, B2,
G1, G2,
M1 和黃
曲霉毒
醇
用乙腈/水
(9/1, v/v)分離提取,
然后采用免疫親和
柱凈化
柱子: ODS
流動相: 水/甲醇/乙腈
60:20:20(v/v/v)
LOD (μg/kg)
0.002~0.012
71.4%~
93% [49]
LC-MS/MS
木薯粉、花
生糕和玉米
樣品
B1, B2
用甲醇/乙酸乙酯/水
(70:20:10, v/v/v)
分離提取;
柱子: Symmetry RP-18
流動相: A: 水: 甲醇: 乙酸
94:5:1 (v/v/v)
含有5 mM 乙酸銨
B: 甲醇: 水: 乙酸
97:2:1 (v/v/v)
包含5 mM 乙酸銨
LOD (μg/kg)
10~346
72%~
120% [50]
LC-MS/MS 飼料
B1, B2,
G1, G2,
M1, M2
用乙腈/水
(84:16, v/v)
分離提取
然后采用
己烷液液萃取
LOD(μg/kg)
0.1~0.8
59%~
107% [51]
Two-dimensional
TLC
牛奶和
冰淇淋
M1
LOD (μg/L)
2
84.6%~
88% [52]
Twodimensional
TLC
巴氏殺菌奶
酸奶, 白奶
酪 黃油
冰淇淋
M1
用飽和氯化鈉和
氯仿分離提取
石英薄層色譜
流動相: 硫酸二乙酯/乙醚/
甲醇/水 94:4.5:1.5 (v/v/v)和
氯仿: 丙酮: 甲醇 87:10:3
(v/v/v)
LOD (μg/L)
0.012
81.4%~
89.5% [53]
TLC 瓜子產(chǎn)品B1
先用加入 5g NaCl 甲醇
/水(80:20, v/v)
后用正己烷分離提取
硅凝膠薄層色譜
流 動 相 : 氯仿: 丙酮
88:12(v/v)
LOD(μg/L)
5
78%~
86% [54]
品中黃曲霉毒素的定性檢測, 大大簡化了檢測步驟。
鄧省亮等[62]用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,
標(biāo)記為抗黃曲霉毒素 B1。單克隆抗體并噴于玻璃纖
維上, 黃曲霉毒素 B1 偶聯(lián)抗原和二抗分別結(jié)合于
硝酸纖維膜上, 依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維膜
和吸水紙組裝切割成膠體金試紙條并裝入檢測卡中。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 黃曲霉毒素 B1 快速檢測試紙條的
靈敏度為 5 ng/mL, 檢測時間為 10 min, 批內(nèi)和批
間重復(fù)性 100%, 假陽性率和假陰性率均為 0。時間
分辨熒光免疫分析法(time resolved fluorescence immunoassay,
TRFIA)利用3 價稀土離子代替酶標(biāo)物或
其他熒光物質(zhì), 用時間分辨熒光儀來測定樣品中熒
光強(qiáng)度來定量。TRFIA 利用稀土離子的熒光波長和
激發(fā)波長的巨大差異來克服了普通分光光度法中雜
色光的影響, 從而提高靈敏度。黃飚等[63]采用自制黃
曲霉毒素 B1 全抗原和多克隆抗體, 構(gòu)建了一套較
1668 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報第 4 卷
為完整的黃曲霉毒素 B1-TRFIA 檢測平臺, 靈敏度
達(dá)到 0.0039 μg/L, 線性范圍 0.0039~100 μg/L, 超過
了市場上常用的進(jìn)口或國產(chǎn)酶聯(lián)免疫檢測試劑 (分
別為 0.1 μg/L 和0.1~10 μg/L), 并具有較好的穩(wěn)定
性。電化學(xué)免疫傳感器包括電容型、阻抗型和電流型,
基于ELISA 法的原理, 在恒定電壓的情況下檢測由
于抗原抗體結(jié)合或繼后反應(yīng)中某電物理量的變化。電
化學(xué)免疫傳感器技術(shù)結(jié)合了抗原抗體反應(yīng)的高特異
性及電化學(xué)分析方法快速、靈敏、簡便、精密度高、
自動化程度好等優(yōu)點(diǎn)。除了上述檢測方法以外, 還有
超光譜法、毛細(xì)管電泳法、金納米棒光學(xué)生物傳感器
技術(shù)、高光譜成像技術(shù)等許多新興的檢測技術(shù), 為黃
曲霉毒素檢測技術(shù)的深入研究提供思路。
3 結(jié) 論
黃曲霉毒素作為一種高毒性的真菌毒素, 可污
染許多重要的作物而進(jìn)入到各種食物中, 對人類健
康產(chǎn)生重大威脅。至今已有很多關(guān)于黃曲霉毒素實(shí)用
檢測技術(shù)的重要研究, 許多分離和檢測技術(shù)已經(jīng)應(yīng)
用于不同基質(zhì)中黃曲霉毒素的檢測。因?yàn)檫@些化合物
在結(jié)構(gòu)上存在明顯不同, 目前試圖使用一種檢測方
法來檢測所有的黃曲霉毒素是不可能的。不同物化性
質(zhì)的各種黃曲霉毒素的有效提取依然是一個巨大的
挑戰(zhàn)。研究各種基質(zhì)中更高效的提取多種黃曲霉毒素
的方法, 開發(fā)更快速、靈敏的檢測技術(shù), 是今后研究
的重點(diǎn)。
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(責(zé)任編輯:趙靜)
作者簡介
羅自生, 教授/系主任, 主要研究方向
為食品保鮮生物學(xué)。

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