導(dǎo)航：安全管理網(wǎng)>> 安全論文>> 食品安全論文>>正文

食品及環(huán)境樣品中腸球菌快速檢驗(yàn)方法的建立及優(yōu)化

文檔作者：彭子欣，王偉，胡豫杰，李鳳琴文檔來(lái)源：國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2025年07月20日
下載地址：點(diǎn)擊這里	文件大?。?1.82 MB 共2頁(yè)	文檔格式： PDF	下載點(diǎn)數(shù)： 1 點(diǎn)（VIP免費(fèi)）

全屏查看

內(nèi)容預(yù)覽 [文件共2頁(yè)]

本文件共2頁(yè)，如需編輯使用，請(qǐng)下載。

注：預(yù)覽效果可能會(huì)出現(xiàn)部分文字亂碼（如口口口）、內(nèi)容顯示不全等問(wèn)題，下載是正常的。

	文件大?。?.82 MB 共2頁(yè) 文件格式：PDF 下載點(diǎn)數(shù)：1 點(diǎn)（VIP會(huì)員免費(fèi)）

下一篇：食品機(jī)械用潤(rùn)滑油（脂）市場(chǎng)分析與進(jìn)出口…

上一篇：食品加工過(guò)程中細(xì)菌生物被膜的危害及控制…

文本預(yù)覽

僅提取頁(yè)面文字內(nèi)容，供快速閱讀使用。

第7卷第6期食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)V01．7 No．6
2016年6月Journal ofFood Safety and Quality Jun．．2016
食品及環(huán)境樣品中腸球菌快速檢驗(yàn)方法的
建立及優(yōu)化
彭子欣，王偉，胡豫杰，李鳳琴+
(國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100021)
摘要：目的建立并優(yōu)化食品及環(huán)境樣品中腸球菌的快速檢驗(yàn)方法。方法用mEI培養(yǎng)基作為選擇性培養(yǎng)
基，腸球菌f∥基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物，建立食品及環(huán)境樣品中腸球菌的快速檢驗(yàn)方法。通過(guò)添加腸球菌和非
腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，驗(yàn)證方法的檢測(cè)限、靈敏度及特異性，并使用優(yōu)化后的方法對(duì)北京市豐臺(tái)區(qū)某大型生鮮豬肉
集貿(mào)市場(chǎng)的地面、墻壁、污水和生鮮豬肉等樣品中的腸球菌進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果所建方法的檢測(cè)限為1 CFU／100
cm2和1 CFU／25 g(mE)，且與1 0種非腸球菌無(wú)交叉反應(yīng)；地面涂抹、墻壁涂抹、污水和生鮮豬肉等樣品中均
檢驗(yàn)出腸球菌，檢出率為100％。結(jié)論建立了簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異的腸球菌檢驗(yàn)方法；集貿(mào)市場(chǎng)內(nèi)部環(huán)
境和生鮮豬肉存在腸球菌污染。應(yīng)加強(qiáng)市售生鮮肉中腸球菌的監(jiān)測(cè)，并采取相應(yīng)措施降低其污染水平。
關(guān)鍵詞：腸球菌；生鮮豬肉；環(huán)境
Development and optimization of rapid detection of Enterococcus spp．
in retailed raw pork and environment samples
PENG Zi—Xin，WANG Wei，HU Yu—Jie，LI Feng—Qin+
(Key Lab ofFood Safety Risk Assessment，Ministry ofHealth，China National Centerfor Food Safety Risk Assessment，
Beijing 10002 1，China)
ABSTRACT：Objective To develop and optimize a method for rapid detection of Enterococci in food and
environment samples．Methods Using reEl as the selective culture-base，followed by Enterococcus spp．tuf
gene--based genus--specific PCR assay,a rapid detection method was established for detection of Enterococci in
retailed raw pork and environment samples．The limit of detection，sensitivity and specificity of the rapid detection
method were tested and verified by adding standard strain Enterococcus faeealis ATCC 292 1 2 and non—enterococcal
standard strains into Enterococcus—free samples，respectively．The method was optimized and used to analyze floor
swab samples，wall swab samples，sewage samples and retailed raw pork samples collected from a farm market in
Fengtai district of Beijing．Results The limit of detection of the established method was 1 CFU／100 cm2 and 1
CFU／25 g(mE)．The method showed no cross—reactivity in determination of 1 0 kinds of non—enterococcal standard
strains．All samples collected from the farm market were positive for Enterococci，the positive detection rate was
100％．Conclusion A rapid，sensitive and specific detection method for Enterococci was developed．It was shown
基金項(xiàng)目：北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助青年拔尖個(gè)人項(xiàng)目(2014000021223ZK46)、北京市科技新星計(jì)劃交叉學(xué)科合作課題(xxjc201601)
Fund：Supported by the Beijing Talents Fund of the Beijing Municipal Organization Department(2014000021223ZK46)and Beijing Nova
Program Interdisciplinary Cooperation Project(xxjc201601)
+通訊作者：李風(fēng)琴，博士，研究員，主要研究方向?yàn)槭称肺⑸铩．mail：lifengqin@efsa．net．cn
+Corresponding author：LI Feng-Qin，Ph D．，Professor,Microbiology Laboratory,China National Center for Food Safety Risk Assessment，No．7，
Panjiayuannanli Road，Chaoyang District，BeOing 10002l，China．E—mail：lifengqin@cfsa net cn
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
第6期彭子欣，等：食品及環(huán)境樣品中腸球菌快速檢驗(yàn)方法的建立及優(yōu)化224l
that internal environment of the farm market，as well as the raw pork were heavily contaminated by Enterococci．In
consequence，action of monitoring Enterococci in raw meat should be strengthened and appropriate measures should
be taken to reduce the contamination level．
KEY WORDS：Enterococci；raw pork；environment
1 引言
腸球菌是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌【l'2】，廣泛分布于
肉制品、奶制品、涼菜等食品中【”。由于該菌對(duì)高鹽和加
熱等處理具有耐受性，易在食品中大量繁殖，因此，由腸
球菌污染引發(fā)的食物中毒事件在我國(guó)屢見(jiàn)不掣4，5J。更為嚴(yán)
重的是，由于腸球菌對(duì)某些抗生素的耐藥性，導(dǎo)致許多臨
床常用抗菌藥物在治療腸球菌感染時(shí)失敗【21，同時(shí)腸球菌
攜帶的耐藥性基因可通過(guò)食物鏈傳遞給食源性致病菌，是
重要食源性致病菌耐藥基因的儲(chǔ)存庫(kù)【6j。
長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為腸球菌是對(duì)人體無(wú)害的共棲性
細(xì)菌，因而忽視了腸球菌引起的食品安全問(wèn)題【4J。我國(guó)至
今尚無(wú)食品中腸球菌的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法和限量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)
行檢驗(yàn)?zāi)c球菌的方法是出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
SN／T1933．1．2007《食品和水中腸球菌檢驗(yàn)方法第一部分平
板計(jì)數(shù)法和最近似值測(cè)定法》和SN／T1933．2—2007《食品和
水中腸球菌檢驗(yàn)方法第二部分濾膜法》17巋]，該檢驗(yàn)方法雖
然準(zhǔn)確可靠，但存在檢驗(yàn)周期長(zhǎng)(最少需要4 d)和鑒定過(guò)程
工作量大等缺點(diǎn)【L引。而基于PCR原理的方法，雖然檢驗(yàn)速
度較快[9jo]，但不能獲得樣品中腸球菌的菌株資源，進(jìn)而
無(wú)法獲知菌株的毒力和耐藥性等重要信息。因此，將傳統(tǒng)
的平板培養(yǎng)分離鑒定法與現(xiàn)代PCR技術(shù)相結(jié)合，建立快
速、簡(jiǎn)便的腸球菌檢驗(yàn)方法勢(shì)在必行。本研究建立了生鮮
豬肉及環(huán)境樣品中腸球菌的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法，
并用所建方法對(duì)市售生鮮豬肉及銷售場(chǎng)所(地面、墻壁和污
水)樣品中腸球菌的污染狀況進(jìn)行調(diào)查。
2材料與方法
2．1 實(shí)驗(yàn)材料
2．1．1 菌株
糞腸球菌ATCC 29212、痢疾志賀菌CMCC 51252、
乙型溶血性鏈球菌CMCC 32210、蠟樣芽孢桿菌ATCC
11778、鼠疫沙門菌ATCC 50333、金黃色葡萄球菌ATCC
29213、銅綠假單胞菌ATCC 27853、阪崎克羅諾桿菌ATcC
29544、單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC 19119、大腸埃希氏
菌ATCC 25922等10株標(biāo)準(zhǔn)菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏，副溶
血性弧菌VP 5521為本實(shí)驗(yàn)室分離株。
2．1．2樣品來(lái)源
地面涂抹樣品、墻壁涂抹樣品、污水樣品和生鮮豬肉
樣品均采自北京市豐臺(tái)區(qū)某大型生鮮豬肉銷售集貿(mào)市場(chǎng)。
2．1．3主要儀器、培養(yǎng)基，試劑及采樣工具
PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio—Rad公司)；
VITEK 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌鑒
定卡(法國(guó)梅里埃公司)；拍擊式勻漿器(法國(guó)Interscience公
司)；漩渦混勻器(德國(guó)IKA公司)。
緩沖蛋白胨水(BPW)、腦心浸液肉湯(BHIB)、腦心浸
液瓊H旨(BHA)、疊氮化鈉葡萄糖肉湯、腸球菌肉湯、腸球
菌瓊脂、mEI腸球菌顯色培養(yǎng)基(mEI)、KF鏈球菌瓊脂
(KF)、膽汁七葉苷瓊脂(BEA)均購(gòu)TJI：京陸橋技術(shù)股份有
限責(zé)任公司。100 bp DNA Ladder(MDl09)和2xTaq PCR
MaterMix(KT201．02)(JL京天根生化有限公司)。
無(wú)菌海綿涂抹拭子(美國(guó)Hygiena公司)；50 mL一次性
無(wú)菌注射器和一次性無(wú)菌采樣瓶(JL京東方藍(lán)天時(shí)科貿(mào)有
限公司1。
2．2實(shí)驗(yàn)方法
2．2．1樣品的采集
地面涂抹樣品采集：在生鮮豬肉銷售攤位前的甬道
中央處采樣。隨機(jī)選取3條甬道，每條甬道采集一個(gè)地面
涂抹樣品，具體采樣方法為：將10 cmx 10 cm無(wú)菌采樣規(guī)
格板平放置地面上，用無(wú)菌海綿涂抹拭子擦涂規(guī)格板方框
內(nèi)的全部面積，將涂抹后棄去拭子柄的海綿拭子放人采樣
袋中，密封后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
墻壁涂抹樣品采集：在生鮮豬肉攤位正對(duì)的墻壁1米
高處采樣。隨機(jī)選取3個(gè)攤位對(duì)應(yīng)的墻面，每面墻壁采集
一個(gè)涂抹樣品，采樣方法同地面涂抹樣品。
污水樣品采集：選取3條甬道，每條甬道隨機(jī)選取一
個(gè)生鮮豬肉攤位，用50 mL一次性注射器從攤位前的排水
渠內(nèi)吸取50 mL污水樣品，裝于無(wú)菌采樣瓶中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室
檢測(cè)。
生鮮豬肉樣品采集：每個(gè)污水樣品采樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)的攤
位，采集生鮮豬肉100 g，裝入攤位提供的塑料袋中，共采
集3個(gè)獨(dú)立攤位的生鮮豬肉樣品。
采集的所有樣品2 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室并完成檢驗(yàn)。
2．2．2樣品的檢驗(yàn)
(1)樣品前處理和前增菌
在裝有地面和墻壁涂抹海綿的采樣袋中分別加入lO
mL無(wú)菌BPW；用無(wú)菌吸管吸取25 mL污水樣品，加入盛
有225 mL BPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中；無(wú)菌稱取25 g生鮮豬肉，
置于盛有225 mL BPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中。上述每個(gè)采樣袋／
均質(zhì)袋分別用拍擊式均質(zhì)器快速拍打1～2 min后，于
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
2242 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)第7卷
(37：L1)℃培養(yǎng)18～24 h進(jìn)行前增菌。每份完成前增菌的樣
品一部分用于以下(2)～(4)的檢驗(yàn)，剩余樣品高壓滅菌后作
為陰性樣品用于2．2．4優(yōu)化后方法檢出限和特異性的確定。
(2)選擇性增菌
從上述(1)中各前增菌液中吸取1 mL，分別加入9 mL
無(wú)菌腸球菌肉湯管和疊氮化鈉葡萄糖肉湯管中，(37土1)℃
培養(yǎng)24 h后，若腸球菌肉湯管顏色變成棕黑色者為陽(yáng)性，
繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，顏色不變者為陰性，結(jié)束實(shí)驗(yàn)；若疊氮化鈉葡
萄糖肉湯管內(nèi)液體變渾濁者為陽(yáng)性，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，不變混濁
者繼續(xù)在(37士1)℃培養(yǎng)24 h，若變}昆濁則為陽(yáng)性，繼續(xù)后
續(xù)鑒定，不變混濁則為陰性，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。
(3)腸球菌的分離
用接種環(huán)分別取陽(yáng)性腸球菌肉湯管和疊氮化鈉葡萄
糖肉湯管內(nèi)菌液各一環(huán)，分別接種到腸球菌平板、KF平板
和mEI平板上，同時(shí)以糞腸球菌ATCC 29212標(biāo)準(zhǔn)菌株做
為陽(yáng)性對(duì)照。將腸球菌平板和KF平板置于(37+11℃培養(yǎng)
20～24 h，mEI平板置于(40士1)℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形
態(tài)。腸球菌在腸球菌平板上形成帶棕色環(huán)的棕黑色菌落(圖
2a)，在KF平板上形成邊緣整齊的暗紅至粉紅色菌落(圖
2b)，在mEI平板上形成帶深藍(lán)色暈輪的菌落(圖2c)。每個(gè)
種類的平板挑選3～5個(gè)典型菌落分別接種到BHIB肉湯管
中和BHA平板上，(37土1)℃培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)物用于腸球
菌的生化和分子鑒定。
(4)腸球菌的鑒定
A1生化鑒定
取BHIB肉湯管中的培養(yǎng)物一環(huán)，分別接種到BEA平
板、BHIB肉湯及含6．5％NaCl的BttlB肉湯管中，挑取
BHA平板上的菌落，分別作革蘭氏染色和VITEK生化鑒
定，同時(shí)以糞腸球菌ATCC 29212標(biāo)準(zhǔn)菌株做為陽(yáng)性對(duì)照。
將BEA平板及含6．5％NaCl的BHIB肉湯管置于(37士1)℃
培養(yǎng)48 h，BHIB肉湯管置于054-1)℃培養(yǎng)48 h。
腸球菌在BEA平板上生長(zhǎng)并水解七葉苷，在棕色菌
落周圍形成黑色或棕色沉淀圈；在BHIB肉湯管中，
(451I 1℃生長(zhǎng)而使液體變渾濁；在含6。5％NaCl的BHIB
肉湯中，(37士1)℃生長(zhǎng)良好而使液體變渾濁；腸球菌染色
后鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性球菌或卵圓形菌，單個(gè)、成雙或短鏈
排列；分離菌株經(jīng)VITEK鑒定，結(jié)果為腸球菌。
B1分子鑒定
模板制備：用無(wú)菌接種環(huán)挑取2．2．20)中BHA平板上
腸球菌疑似菌落的少量菌苔，在200此無(wú)菌超純水中混勻
于100℃水浴中加熱10 min后，13000 r／min離心2 min，上
清液即為制備好的DNA模板，將DNA模板轉(zhuǎn)于另一無(wú)
菌離心管中備用，同時(shí)以糞腸球菌ATcc 29212作為陽(yáng)性
對(duì)照。
引物合成：根據(jù)腸球菌屬高度保守的tuf基因片段設(shè)
計(jì)特異性引物Entl和Ent2[11]，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 12 bp，引
物序列信息為：Entl：5'-TACTGACAAACCATTCATGATG．
3’：Ent2：5'-AATTCGTCACCAACGCGAAC．3’。
PCR反應(yīng)體系組成為：PCR Mix 10 gL，Primer Entl 1
gL，Primer Ent2 1 pL，ddH20 6 gL，DNA模板2 gL，PCR總
體系為20止。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性6 rnin后，按
照95℃0．5 rain，55℃0．5 mm，72℃0．5 min進(jìn)行30個(gè)循
環(huán)：然后72℃延伸7 min。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，分別取10 gL PCR產(chǎn)物，與2此
6xloading buffer混勻后，加樣于點(diǎn)樣孔中。5 V／cm電泳
30．40 rain。與對(duì)照相比，若在112 bp處出現(xiàn)目的條帶者則
為陽(yáng)性。
2．2．3檢驗(yàn)方法的優(yōu)化
通過(guò)優(yōu)化形成食品及環(huán)境中腸球菌的快速、簡(jiǎn)便檢驗(yàn)
方法(見(jiàn)圖3)，具體為：食品及環(huán)境樣品經(jīng)前處理和前增菌
后，吸取l mL前增菌液加入9 mL腸球菌肉湯中，(37土1)℃
培養(yǎng)24 h，取l環(huán)增菌液劃線接種mEI平板，(40±1)℃培養(yǎng)
24 h，挑取平板上的疑似菌落接種BHA平板，PCR鑒定結(jié)
果為陽(yáng)性的菌株確認(rèn)為腸球菌。
2．2．4 PCR方法檢出限和特異性的確定
(1)菌懸液的制備
將糞腸球菌ATCC 29212經(jīng)BHA平板傳代活化后，用
無(wú)菌生理鹽水分別制備濃度為108～10。1CFU／mL的菌懸液。
按照同樣方法制備痢疾志賀菌CMCC 51252、乙型溶血性
鏈球菌CMCC 32210、蠟樣芽孢桿菌ATCC 11778、鼠疫沙
門菌ATCC 50333、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、銅綠假
單胞菌ATCC 27853、阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544、單核
細(xì)胞增生李斯特菌ATCC 19119、大腸埃希氏菌ATCC
25922等9株標(biāo)準(zhǔn)菌和副溶血性弧菌VP 5521的菌懸液。
分別取100皿濃度為103、102、101和100 CFU／mL的上述
菌懸液涂平板，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，(37士1)℃培養(yǎng)24 h
進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
(2)檢測(cè)限和特異性的確定
向2．2．2(1)中完成前增菌并高壓滅菌的每種樣品的3
個(gè)平行中，分別添加濃度為101、100、10。1 CFU／mL的上述
1 1種菌株的菌懸液各1 mL，用拍擊式均質(zhì)器快速拍打l～2
min，使樣品染菌濃度分別為101、100、10’1 CFU／100 cm2(地
面涂抹和墻壁涂抹樣品)，101、100、10。1 CFU／25 g(生鮮豬
肉樣品)和101、100、10。1 CFU／25 mE(污水樣品)，按圖3所
示程序檢驗(yàn)樣品，確定優(yōu)化方法的檢測(cè)限和特異性。
3結(jié)果與分析
3．1 地面涂抹、墻壁涂抹、污水及市售生鮮豬肉等
樣品中腸球菌的檢驗(yàn)結(jié)果
從豐臺(tái)區(qū)某大型生鮮豬肉集貿(mào)市場(chǎng)采集的地面涂抹、
墻壁涂抹、污水和生鮮豬肉各3份樣品中均檢驗(yàn)出腸球菌，
檢出率為100％。經(jīng)表型、生化及PCR鑒定，從上述樣品
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
第6期彭子欣，等：食品及環(huán)境樣品中腸球菌快速檢驗(yàn)方法的建立及fJ亡化2243
中共分離出腸球菌86株。其中從地面涂抹樣品、墻壁涂抹
樣品、污水樣品和生鮮豬肉樣品中分別分離出29株、14
株、21株和22株腸球菌。
3．2前增菌和選擇性增菌在腸球菌分離中的比較研究
由于集貿(mào)市場(chǎng)環(huán)境和生鮮豬肉樣品中微生物背景復(fù)
雜，如果樣品混懸液不進(jìn)行選擇性增菌，直接劃線接種選
擇性平板，大量雜菌將干擾目標(biāo)菌的檢出，造成腸球菌分
離率低，而選擇性增菌步驟提高了腸球菌的檢驗(yàn)效率。
腸球菌肉湯和疊氮化鈉葡萄糖肉湯都可用于腸球菌
的選擇性增菌液。本研究結(jié)果顯示，腸球菌肉湯管中接種
腸球菌培養(yǎng)24 h后，肉湯顏色由黃色變?yōu)樽睾谏?，易于?
別(圖1a)；而疊氮化鈉葡萄糖肉湯接種腸球菌培養(yǎng)24 h后，
陽(yáng)性管呈現(xiàn)混濁狀態(tài)，但無(wú)顏色變化，對(duì)于培養(yǎng)24 h后不
變混濁的樣品管，還需繼續(xù)培養(yǎng)24 h。因此用疊氮化鈉葡
萄糖肉湯作為選擇性增菌液，其結(jié)果不易于辨別且檢驗(yàn)時(shí)
間較長(zhǎng)(圖lb)。因此推薦腸球菌肉湯作為選擇性增菌液用
于后續(xù)研究。
3．3不同選擇性平板對(duì)腸球菌分離效果的比較
腸球菌接種腸球菌平板后，菌落周圍的棕色環(huán)易連
成片，導(dǎo)致難以判斷(圖2a)。本研究采集的樣品在該平板
上共分離獲得疑似腸球菌32株，經(jīng)分子和生化鑒定確認(rèn)為
腸球菌者27株，正確率84．4％。腸球菌在KF平板上形成
的紅色菌落較小(圖2b)，生長(zhǎng)較慢，本研究采集的樣品在
KF平板上獲得疑似菌株的正確率為83．3％(15／18)。腸球菌
在mEI平板上形成的帶深藍(lán)色暈輪菌落較大，易于辨識(shí)
(圖2c)，經(jīng)鑒定本研究采集的樣品在該平板上的疑似腸球
菌正確率為89．8％(44／49)。綜合以上結(jié)果，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)
中使用mEI平板作為腸球菌分離的選擇性平板。
(b)
圖1糞腸球菌ATCC29212在腸球菌肉湯(a)和疊氮化鈉葡萄糖肉
湯(b)中的增菌效果比較(左：陽(yáng)性管；右：陰性管)
Fig．1 Enrichment ofE．faecalis ATCC29212 in Enterococcus broth
(a)and sodium azide glucose broth(b)
(Left：Positive Right：Negative)
(a)
(b)
圖2糞腸球菌ATCC 29212在3種腸球菌選擇性平板上的菌落形
態(tài)腸球菌平板；(b)gF平板；(c)n1EI平板
Fig．2 Morphology ofE．faecalis ATCC29212on 3 kinds ofselective
media Enterococcus medium；(b)KF medium；(c)mEI medium
3．4生化鑒定和分子鑒定
腸球菌傳統(tǒng)生化鑒定包括鏡檢、耐6．5％NaCl、耐45℃
高溫和水解七葉苷四項(xiàng)，鑒定過(guò)程復(fù)雜且步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)
費(fèi)力。如圖3所示，腸球菌陽(yáng)性株可以擴(kuò)增出112 bp的tuf
基因，陰性株不能擴(kuò)增出相應(yīng)大小條帶。本研究分離到的
93株疑似腸球菌的生化鑒定、PCR和VITEK 3項(xiàng)結(jié)果比
較顯示，3者的符合率為loo％(部分菌株的鑒定結(jié)果見(jiàn)表
1)。與生化鑒定和VITEK鑒定比較，PCR鑒定快捷而準(zhǔn)確，
且價(jià)格低廉，易于在基層檢驗(yàn)單位推廣和普及。同時(shí)，確定
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
2244 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)第7卷
后續(xù)試驗(yàn)中使用PCR鑒定作為腸球菌的確證檢驗(yàn)方法。
綜合3．2-3．4研究結(jié)果，形成腸球菌優(yōu)化檢驗(yàn)程序見(jiàn)
圖4。
3．5 PCR方法的檢出限和特異性
將濃度為103、102、101和lOo CFU／mL的糞腸球菌
ATCC 29212菌懸液涂布于BHA平板并培養(yǎng)計(jì)數(shù)，實(shí)際計(jì)
數(shù)結(jié)果分別為1．11×103、1．31×102、1．2×101和2×100
CFU／mL。
向經(jīng)高壓滅菌的地面涂抹、墻壁涂抹、污水和生鮮豬
肉各3個(gè)樣品中，分別人工污染濃度分別為101、100、10。
CFU／mL的1 1種致病菌后，經(jīng)本研究建立的檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)，
腸球菌的檢出限均為100 CFU／100 cm2和100 CFU／25
g(mL)。而且，各樣品在mEI平板上挑選的5個(gè)典型菌落，
經(jīng)PCR鑒定均為腸球菌，非腸球菌檢驗(yàn)結(jié)果均為陰性。以
上結(jié)果說(shuō)明，本研究建立的方法可以靈敏地檢驗(yàn)出樣品中
污染的腸球菌，且方法特異性高。
2 bp
l 2 3 4
■——■ r———r ／
200 bp
100 bp
圖3腸球菌n礦基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig．3 Detection of tufgene ofEnterococcus spp．
1：陰性菌株；2，3：陽(yáng)性菌落；4：100bpDNALadder
1：Negative strain；2．3：Positive strains；4：100 bp DNA Ladder
表1生鮮豬肉集貿(mào)市場(chǎng)豬肉及環(huán)境樣品中分離出的部分腸球菌疑似菌落的不同鑒定方法結(jié)果比較
Table 1 Comparison of Enterococcus isolated from retailed pork and environment samples collected from market identified by
different methods
、‘+”代表陽(yáng)性結(jié)果；“一”代表陰性結(jié)果；“×，'代表無(wú)鑒定結(jié)果。
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
第6期彭子欣，等：食品及環(huán)境樣品中腸球菌快速檢驗(yàn)方法的建立及優(yōu)化2245
地面涂抹樣品
和墻壁涂抹樣品
分別在采樣袋中
加入10mL BPW，均質(zhì)
污水樣品和生鮮豬肉樣品
分別吸(稱)取25 mL(g)置于
225mLBPW均質(zhì)袋中，均質(zhì)
37。C預(yù)增菌18．24 h
腸球菌肉湯1
0 37。C增菌24 h
J reel平板i
、l 40。C培養(yǎng)24h
每個(gè)平板挑取l
疑似菌落3．5株j
PCR鑒定
鑒定為腸球菌
圖4腸球菌檢驗(yàn)程序
Fig．4 Protocol used to detect Enterococcus spp
4討論
傳統(tǒng)腸球菌檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)結(jié)果雖然準(zhǔn)確可靠，但
是檢驗(yàn)流程較長(zhǎng)，步驟繁瑣，整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程至少要96 h。
本研究將傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和PCR技術(shù)相結(jié)合，簡(jiǎn)化了生化
鑒定流程，減少了檢驗(yàn)過(guò)程的工作量，使整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程能
夠在72 h內(nèi)完成，提高了檢驗(yàn)效率。
增菌肉湯和篩選平板的選擇是決定食品微生物檢測(cè)
效率的重要因素。本研究比較了腸球菌肉湯和疊氮化鈉葡
萄糖肉湯對(duì)腸球菌的增菌效率。結(jié)果顯示，使用這兩種肉
湯均可檢出豬肉及環(huán)境樣品中濃度低至100 cFU／mL的腸
球菌，但腸球菌肉湯培養(yǎng)時(shí)間短，而且陽(yáng)性樣品的顏色更
易于辨識(shí)。肖群等【12】報(bào)道腸球菌肉湯檢驗(yàn)?zāi)c球菌的效率較
疊氮化鈉葡萄糖肉湯具有明顯優(yōu)勢(shì)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意
義(JD<0．05)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)腸球菌檢驗(yàn)肉湯的優(yōu)勢(shì)。
PCR檢測(cè)技術(shù)雖然越來(lái)越多的用于食品微生物的檢
驗(yàn)，但是由于這種技術(shù)不能獲得致病菌的菌種，進(jìn)而影響
對(duì)食品中致病菌的追蹤、溯源和深入研究，因此不能完全
替代傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)分離鑒定法。本研究將平板培養(yǎng)分離
鑒定法與PCR技術(shù)相結(jié)合，即可節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間，又可獲得
致病菌的菌種資源。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，熒光定量PCR法檢測(cè)食
源性腸球菌的檢出限為2．63 CFU／mLE10]，而本研究建立方
法的檢出限為1 CFU／mL，較熒光定量PCR法更為靈敏。
本研究中腸球菌在mEI平板上的正確率為89．8％，干
擾菌株經(jīng)VITEK鑒定為河流漫游球菌、產(chǎn)色葡萄球菌和綠
色氣球菌(表1)。Ryu等[”]報(bào)道美國(guó)河流水樣、動(dòng)物和人糞
便樣品中腸球菌在mEI平板上的正確率為91％，干擾菌為
氣球菌屬、格式乳球菌、戊糖片球菌和Streptococcus
gallolyticl2S subsp．pasteurianus。本研究中腸球菌在mEI平
板上的正確率略低于上述報(bào)道，這可能與檢測(cè)樣品的類型
不同有關(guān)。Maraccini等【14】報(bào)道m(xù)EI平板上假陽(yáng)性菌大多
數(shù)為綠色氣球菌。根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果可知，mEI平板對(duì)于腸
球菌的選擇性很強(qiáng)，少量假陽(yáng)性菌株通過(guò)后續(xù)PCR和生化
鑒定易于辨別，便于腸球菌的分離鑒定。
Ke等【”】根據(jù)腸球菌屬f“，基因上的保守序列設(shè)計(jì)了一
對(duì)可以擴(kuò)增112 bp片段的特異性引物。該引物可以特異性
擴(kuò)增腸球菌中除E．solitarius以外的所有菌種，并且和79
種非腸球菌中的75種菌(94．94％)無(wú)非特異性擴(kuò)增【”]。鑒于
這對(duì)引物的高特異性，Moritz[11]和Fouadtl6]分別使用這對(duì)
引物用于臨床病患感染樣本中腸球菌的分離鑒定，本研究
基于tuf基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得和生化實(shí)驗(yàn)一
致的鑒定結(jié)果。
腸球菌不僅僅是潛在的致病菌，而且是細(xì)菌耐藥基
因和毒力基因的天然儲(chǔ)存庫(kù)。段志剛等【l‘7】報(bào)道，從鄭州市
農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷售的52份鮮豬肉中分離出30株腸球菌，這些
腸球菌對(duì)卡那霉素、紅霉素和強(qiáng)力霉素的耐藥率為
73．3％～86．7％。Pesavento等【3]、Valenzuela等【6l和Jahana
等【10】研究發(fā)現(xiàn)，生肉中腸球菌檢出率高達(dá)44．3％～68．2％，
且具有多重耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，北京市生肉集貿(mào)市場(chǎng)的
環(huán)境樣品和市售生鮮肉中腸球菌檢出率為100％。這一研
究結(jié)果提示，有必要加強(qiáng)生鮮肉類和肉類出售環(huán)境中腸球
菌污染的監(jiān)測(cè)，以降低生鮮肉類中腸球菌的污染和耐藥性
傳播。
參考文獻(xiàn)
[1】Khan S，Sung K，Marasa B，et al Draft genome sequence of
multidmg-resistant Enterococcus faecium clinical isolate VRE3，with a
sequence type 16 pattem and novel structural arrangement of Tnl546[J】，
GenomeA，2015，3(4)：e0087l一15
【2】Diaz L，Tran T，Munita J，et al Whole-genome analyses of Enterococcus
扣ecium isolates with diverse daptomycin MICs[J]Antirnicrob Agents
Chem，2014，58(8)：4527-4534
[3】Pesavento G Calonico C，Ducci B，et al Prevalence and antibiotic
resistance ofEnterococcus spp．isolated from retail cheese，ready—to-eat
salads，ham，and raw meat[JJ Food Microbiol，2014，41：1-7，
[4]楊毓環(huán)，馬群飛，洪錦春多種腸球菌污染引起的腸球菌性食物中毒
的實(shí)驗(yàn)室調(diào)查分析【J1．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，12：2664—2666，
Yang YH，Ma QF,Hong JC．Laboratory investigation on a food poisoning
case caused by a variety of enterococcus【J】Chin J Health Lab Technol，
2013．12：2664—2666
[5】李曉檸，李鴻嗚，李彬，等一起由糞腸球菌引起的食物中毒【J]，預(yù)防
醫(yī)學(xué)論壇，2006，12(4)：498-498
Li XN，Li HM，Li B，el al A case of food poison caused by Enterococcus
扣ecalis[J】Prev Med Trib，2006，12(4)：498-498
[6】Valenzuela AS，Omar N，Abriouel H，et al Virulence factors，antibiotic
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
2246 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)第7卷
resistance，and bacteriocins in Enterococci from artisan foods of animal
origin[J】Food Con仃ol，2009，20(4)：381—385．
【7】SN／T 1933．1—2007食品和水中腸球菌檢驗(yàn)方法第1部分：平板計(jì)數(shù)法
和最近似值測(cè)定法【s】．
SN／T 1933．1-2007 Detection of Enterococci in food and watere of C1：
Method forplate connt and MPN[S]．
[8】8 SN／T 1933．2．2007中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)食品和水
中腸球菌檢驗(yàn)方法第2部分：濾膜法【s】．
SN廠r 1933．2．2007 Detection of Enterococci in food and water of
ehinaion ofqualimembrane filtration【S】．
[9】吳晨璐，施春雷，周筑等．食源性腸球菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的
建立與評(píng)價(jià)叨．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30(5)：779_787．
Wu CL，Shi CL，Zhou M，et a1．Development and evaluation ofa real-time
PCRsystem for Enterococcus spp，detection in food sample[J]．J Food Sci
Tcch，201 1，30(5)：779—787．
【10】Jahana M，Kranseb D，Holley R．Antimicrobial resistance
ofEnterococcus species from meat and fermented meat products isolated
by aPCR-based rapid screening method【J1．Int J Food Micmbiol，2013，
163(2—3)：89-95．
[1 1】Modtz E，Hergenrother E Toxin-antitoxin systems ale ubiquitous
andplasmid-encoded in vancomycin-resistant enteroeoeei【J]．P Natl Aead
Sci，2007，104(1)：311-316．
[12】肖群．不同培養(yǎng)基對(duì)腸球菌的檢測(cè)效果分析田．現(xiàn)代診斷與治療，2012，
23(9)：1370-1371．
Xiao Q．Comparison of different culture media for detection of
Enterococci[J]．ModDiagTreat，2012，23(9)：1370-1371．
[13]Ryu H，Henson M，Elk M，et a1．Development of quantitative PCRassays
targeting the 16S rRNA genes of Enterococcus spp．a(chǎn)nd their application
to the identification of enterococcus species
in environmental samples[J】．
Appl Environ Microbiol，2013，79(1)：196-204．
Maraccini PA，F(xiàn)erguson DM，Boehm AB．Diurnal variation in
Enterococcus species composition in polluted oeeMln water and apotential
role for the Enterococcal carotenoid in protection against
photoinactivation川．Appl Environ Microbiol，2012，78(2)：305—3 10．
Kc D，Picard FJ，Martineau F’et a1．Development ofa PCRassay for rapid
detectionofEnterococci【J】．JClinMierobiol，1999，3701)：3497—3503．
Fouad AF,Barry J，Caimano M，et a1．PCR-based identification ofbacteria
associated塒th eododontic infections[J】．J Clin Microbiol，2002，40(9)：
3223-3231．
段志剛，王亞賓，胡惠，等．零售鮮豬肉中腸球菌的鑒定與毒力基因檢
測(cè)[J】．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(24)：20-23．
Duan ZG Wang YB，Hu H，et a1．Identification of Enterococcus from
retail pork and detection ofvirulence factor gene【J]，Chin Agric Sci Bull，
2009．25(24)：20一23．
(責(zé)任編輯：金延秋)
彭子欣，博士，副研究員，主要研究
方向?yàn)槭称肺⑸铩?
E—mail：pengzixin@cfsa．net．cn
李鳳琴，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，
主要研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?
E-mail：lifengqin@cfsa．net．cn
4
5
6
7

網(wǎng)友評(píng)論 more

食品安全論文最新內(nèi)容

07-20