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實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用

文檔作者：竇麗芳　李夢(mèng)迪　方慧文文檔來(lái)源：武漢產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所國(guó)家飲料及糧油制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2025年07月15日
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July 2015 CHINA FOOD SAFETY 137
科技文苑
近年來(lái)，全球食品安全面臨著潛
在風(fēng)險(xiǎn)和巨大挑戰(zhàn)，其中食源性致病
菌、未知有害生物物質(zhì)、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品
等生物領(lǐng)域成為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和
控制的重要領(lǐng)域之一。由于自然界的
每一物種都有完全不同于他物種高度
保守的核酸(DNA 和RNA) 序列，以核酸
為載體的實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)（Real-Time
PCR），能實(shí)現(xiàn)微量核酸的百萬(wàn)倍擴(kuò)增，
目前公認(rèn)為核酸檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是在傳統(tǒng)PCR
技術(shù)上發(fā)展而來(lái)，借助加入反應(yīng)體系
中熒光基團(tuán)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)
的積累從而監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，通過
標(biāo)準(zhǔn)曲線或“歸一化”數(shù)據(jù)處理對(duì)未
知樣品進(jìn)行絕對(duì)或相對(duì)定量分析和
定性分析[1]。基于“Ct 值與模板初
始濃度在指數(shù)增長(zhǎng)期呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系
的數(shù)學(xué)原理”，“ 熒光探針的熒光
共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，fluorescence
resonance energy transfer, FRET）
的化學(xué)原理”和“激光激發(fā)，一定波
長(zhǎng)連續(xù)、多個(gè)染料同時(shí)監(jiān)測(cè)的光學(xué)原
理”建立的Real-Time PCR 技術(shù)能滿
足食品檢測(cè)更快速、更靈敏、更特異
的食品篩查檢測(cè)需求，由于該技術(shù)可
以在同一封閉管實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)或多個(gè)靶
基因同時(shí)監(jiān)測(cè)，既節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間、
增加檢測(cè)通量，又避免后處理對(duì)環(huán)境
的污染。同時(shí)Real-Time PCR 聯(lián)合分
子指紋圖技術(shù)如單鏈構(gòu)造多態(tài)性(PCRSSCP，
single strand conformation
polymorphisms)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)
性（PCR- RFLP restriction fragment
length polymorphisms RFLP)、變性梯
度凝膠電泳（PCR-DGGE， denaturing
gradient gel electrophoresis）、隨
機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (PCR-RAPD，random
amplified polymorphic DNA) 和質(zhì)譜
技術(shù)如多重PCR- 變性高效液相色
譜（MPCR-DHPLC，denaturing high
performance liquid chromatography）
等實(shí)現(xiàn)食源性致病菌、食品發(fā)酵工藝
微生物群落、乳酸菌等益生菌物種的
鑒定和多態(tài)性評(píng)價(jià)。
本文側(cè)重生物信息和PCR 技術(shù)的
聯(lián)合應(yīng)用，概述目前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行有效
標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道在微生物檢測(cè)領(lǐng)
域、動(dòng)物源性食品、食品中過敏原成分、
食品真?zhèn)舞b定等食品檢測(cè)領(lǐng)域方面的
應(yīng)用，發(fā)展趨勢(shì)、存在的挑戰(zhàn)、亟須
解決的問和最新進(jìn)展。
1 食源性致病菌檢測(cè)
食源性致病菌是食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)
測(cè)的重要對(duì)象，含蛋白、脂肪和水分
等營(yíng)養(yǎng)成分高的食物也是各種細(xì)菌、
真菌和寄生蟲的理想食物，當(dāng)前食源
性致病菌檢測(cè)技術(shù)向更加特異、靈敏、
快速和自動(dòng)化方向發(fā)展[2]。
靶基因設(shè)計(jì)是微生物特異性鑒定的
關(guān)鍵，理想的靶基因能準(zhǔn)確的將含靶
目標(biāo)的生物和不含靶目標(biāo)的生物區(qū)分開
來(lái)。微生物菌種屬種的鑒定通常采用
16S rRNA 和23S rRNA 高度保守區(qū)、可
變區(qū)及16S rRNA 和23S rRNA 的間區(qū)。
對(duì)于親緣關(guān)系遠(yuǎn)的通常采用16S rRNA
和23S rRNA 高度保守區(qū)，而同源關(guān)系
相近的種特異性常常選擇16S rRNA 和
23S rRNA 的間區(qū)作為引物設(shè)計(jì)部位，
可能因?yàn)檫@些部位沒有16S rRNA 和
23S rRNA 特異功能, 從而在物種進(jìn)化過
程中沒有受到較大的選擇壓力。以細(xì)菌
鑒定為目的選擇的靶基因，首先考慮質(zhì)
粒上的毒力因子，如毒力島SP11 基因
之一的invA 基因?qū)ι抽T氏菌的屬鑒定。
因?yàn)橥ǔ６玖σ蜃訛榫曛虏⌒缘闹饕?
因子，且對(duì)于大腸埃希氏菌和小腸結(jié)腸
耶爾森菌，通常認(rèn)為只有產(chǎn)毒菌株才致
實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)在食品檢驗(yàn)領(lǐng)域
的應(yīng)用
□竇麗芳　李夢(mèng)迪　方慧文　武漢產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，國(guó)家飲料及糧油制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心
摘　要：食源性致病菌、轉(zhuǎn)基因食品等生物污染監(jiān)測(cè)和控制是食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和控制的重要領(lǐng)域之一，核酸作為每
一物種獨(dú)一無(wú)二的身份證明，在食源性致病菌、益生菌、動(dòng)物源性食品、過敏原食品、轉(zhuǎn)基因食品乃至食品真?zhèn)舞b定和檢
測(cè)中是最理想的檢測(cè)載體，結(jié)合強(qiáng)大的實(shí)時(shí)熒光PCR 核酸檢測(cè)技術(shù)，為食品安全監(jiān)測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及食品品質(zhì)保障提供了有
利的技術(shù)支撐。本文對(duì)目前實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用和進(jìn)展作一概述。
關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光PCR；食源性致病菌；轉(zhuǎn)基因食品；食品過敏原；益生菌；動(dòng)物源性食品；食品真?zhèn)舞b定
138 食品安全導(dǎo)刊 2015年7月
Technology
科技
科技文苑
病, 所以毒力基因?yàn)榘谢驒z測(cè)這兩種
菌對(duì)于食品微生物篩查才有意義。但有
些毒力基因不穩(wěn)定, 在實(shí)驗(yàn)室操作過程
中容易丟失, 可能導(dǎo)致PCR 檢測(cè)的假陰
性，所以盡量選擇受外界因素干擾小、
穩(wěn)定的靶基因，如志賀氏菌ipaH 基因，
多拷貝存在于染色體和侵襲性大質(zhì)粒
上，不隨傳代而丟失，具備較好的穩(wěn)定
性和特異性。而有些毒力基因在多個(gè)種
屬間具有較高同源性，可能導(dǎo)致PCR 檢
測(cè)的假陽(yáng)性，所以可以聯(lián)合幾種靶基因
多重PCR，增加檢測(cè)的特異性，如加拿
大MFLP-23 標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)副溶血性弧菌選
擇物種特異性基因16S rRNA 聯(lián)合毒性
基因r72h、溶血素tdh 和trh 基因多重
PCR 檢測(cè)[2]。此外，陰性對(duì)照菌株和陽(yáng)
性對(duì)照菌株選擇的覆蓋面及PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)
證也是特異性檢測(cè)的重要保障。
食品中微生物分布具有隨機(jī)性、
低豐度和分類廣等特點(diǎn)。目前對(duì)食源
性微生物檢測(cè)模式主要為目標(biāo)檢測(cè)菌
的選擇性富集培養(yǎng)結(jié)合單重或多重
Real-Time PCR 技術(shù)。對(duì)食物樣品先
行富集再行檢測(cè)可以增加樣品中微生
物絕對(duì)數(shù)量，初篩和分離純化目標(biāo)微
生物，且在一定程度上保證檢測(cè)的活
菌，增強(qiáng)食品安全監(jiān)測(cè)和評(píng)估的真實(shí)
性和準(zhǔn)確性[3]。多篇文獻(xiàn)報(bào)道顯示，
Real-Time PCR 檢測(cè)致病菌靈敏度為
2.0×102 ～ 1.0×103, ，模擬自然污
染進(jìn)行人工加菌檢測(cè)富集培養(yǎng)一定時(shí)
間后Real-Time PCR 檢測(cè)靈敏度，每
25g 樣品為1 ～ 5CFU[4、5、6]。但是，增
菌培養(yǎng)基中食品基質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于待
檢微生物的量，食品復(fù)雜基質(zhì)、培養(yǎng)
基共提取物等都會(huì)嚴(yán)重影響基因組DNA
的分離和提取質(zhì)量，選擇合適方式對(duì)
菌種進(jìn)行選擇性吸附和濃縮并對(duì)核酸
提取質(zhì)量有效評(píng)價(jià)是保證Real-Time
PCR 檢測(cè)靈敏、特異的又一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
可以采取對(duì)瓊脂平板或選擇性平板分
離的純菌落進(jìn)行鑒定或通過對(duì)樣品進(jìn)
行合理的稀釋、離心或過濾方法先行
去除大的食物顆粒, 提取DNA 之前利
用差速離心、免疫磁珠分離、稀釋和
加入牛血清白蛋白將細(xì)菌從食品基質(zhì)
中分離出來(lái)等方式解決。
PCR 聯(lián)合質(zhì)譜和分子指紋的技術(shù)聯(lián)
合，多重靶基因檢測(cè)的多重PCR 靶基
因聯(lián)合以及富集培養(yǎng)和PCR 結(jié)合的模
式聯(lián)合，保證了Real-Time PCR 能夠
勝任食品安全快速篩查檢測(cè)的重任。
SNT 2562-2010， 采用多重PCR 聯(lián)合
DHPLC 技術(shù)， 選取膠原酶基因，CTXA
基因，TCPA 基因和LPSgt 基因?qū)魜y
弧菌實(shí)現(xiàn)01、0139 和非01/0139 的
快速分群檢測(cè)。SNT 2797-2010，選取
ETEA lt 基因，EHEC rfbE 基因，EIEC
ial 基因和EPEC bfp， 采用MPCRDHPLC
技術(shù)快速對(duì)食品中致瀉大腸埃
希氏菌分群鑒定。SNT 2143-2008，
聯(lián)合PCR 與RFLP 技術(shù)檢測(cè)水果、果
汁、牛奶、葉類蔬菜及貝殼類中的隱
孢子蟲。SNT 2563-2010，采用MPCRDHPLC
技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)肉及肉制品中常見的
沙門invA、單增PfrA、空彎CdtA、小
腸結(jié)腸耶爾森16SrRNA、金葡FemA、
溶鏈Cfb 等 6 種致病菌的同時(shí)檢測(cè)。
與傳統(tǒng)培養(yǎng)鏡檢生化血清傳統(tǒng)
微生物檢測(cè)模式相比，Real-Time
PCR 檢測(cè)更加快速、靈敏、簡(jiǎn)便，
目前各PCR 實(shí)驗(yàn)室主流PCR 儀主要
為AB 公司7700 、7500、79 系統(tǒng)；
Roche 公司的LightCycler 系統(tǒng)；Bio
Rad 公司iCycler Thernal 、Cycler
系統(tǒng)以及Organon Teknika 公司的
NucliSensEasyQ 系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自
動(dòng)化。食源性致病菌研究工作還要進(jìn)
一步深入，在掌握更多生物信息的基
礎(chǔ)上，結(jié)合PCR 儀器檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，向食
源性真菌毒素、寄生蟲、食源性病毒
等更深入的領(lǐng)域探索。
2 益生菌檢測(cè)
乳酸菌因能改善腸道微態(tài)平衡促
進(jìn)人體健康，近年來(lái)被廣泛關(guān)注。衛(wèi)
生部2010 年65 號(hào)文（衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)〔
2010〕65 號(hào)）規(guī)定我國(guó)可用于食品的
乳酸菌種主要包括嗜酸乳桿菌、干酪
乳桿菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿
菌等乳桿菌屬14 個(gè)菌種；包括青春雙
歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌（乳雙歧桿菌）、
兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙
歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌的雙歧桿菌屬6
個(gè)菌種。酸乳發(fā)酵劑中不同種類乳酸
菌不同發(fā)酵乳的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏、產(chǎn)香及
分解蛋白質(zhì)的能力不同，直接影響酸
乳的口感和品質(zhì)。食品工藝和食品安
全的要求決定對(duì)乳酸菌在菌株水平的
鑒定至關(guān)重要。而目前雙歧桿菌屬菌
株水平鑒定僅限于培養(yǎng)法GB478.34-
2012，不僅生化鑒定繁瑣且要需要
氣相色譜法鑒定乙酸、乳酸等有機(jī)酸
代謝產(chǎn)物，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。乳桿菌屬水平
鑒定僅有普通PCR 方法SN 1941.3-
2007，而菌株水平的鑒定仍只能參考
培養(yǎng)法GB4789.35-2010，且培養(yǎng)法和
目前全自動(dòng)生化鑒定儀菌株數(shù)據(jù)庫(kù)還
不能全部覆蓋所有14 個(gè)菌種，檢測(cè)方
法上存在真空。
目前對(duì)乳酸菌菌種鑒定和鑒別的
研究較多，屬種間鑒定仍然采用16S
July 2015 CHINA FOOD SAFETY 139
科技文苑
rRNA 序列，有報(bào)道該靶基因可以鑒別
鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、兩歧雙
歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌，但不能鑒別干
酪乳桿菌和副干酪乳桿菌[7]。基因指
紋圖譜技術(shù)如RAPD、RFLP、DGGE、
ARDRA ( 核糖體DNA 擴(kuò)增片段限制性
內(nèi)切酶分析，amplified ribosomal
DNA restriction analysis) 和PCR 聯(lián)合
技術(shù)如Rep-PCR ( 細(xì)菌基因組重復(fù)序
列PCR 技術(shù)，repetitive extragenic
palindromic PCR), TAP-PCR ( 三重隨機(jī)
引物PCR, triplicate arbitrary primed
PCR)有很強(qiáng)的種間鑒定和鑒別能力[8]，
但目前僅限于研究，而要廣泛常規(guī)開
展需要進(jìn)一步探索。
3 動(dòng)物源性成分檢測(cè)
近年來(lái)，瘋牛病、羊瘙癢病及禽
流感等疾病的出現(xiàn)，人們對(duì)畜、禽等
肉制品的食用安全和食用品質(zhì)更加關(guān)
注，以及宗教、經(jīng)濟(jì)和市場(chǎng)監(jiān)管的需
要共同催生了對(duì)動(dòng)物源性成份的鑒定
和鑒別檢測(cè)的需求。DNA 作為動(dòng)物源
性成分檢測(cè)的對(duì)象，不存在蛋白質(zhì)成
分易被加工處理而被破壞、變性，難
以鑒別的弊端，因其在各種肉制品加
工過程中很穩(wěn)定，適用于對(duì)未加工和
深加工食品, 包括生鮮、冷凍和熟熱
制品等各種食品狀態(tài)的檢驗(yàn)。目前對(duì)
各類肉制品檢測(cè)的靶基因主要為真核
生物18S rRNA 基因和線粒體細(xì)胞色素
b 基因等屬特異性基因，SN/T 2051-
2008 采用Real-Time PCR 對(duì)食品、飼
料和化妝品中牛、羊和豬源性成分進(jìn)
行鑒定；Tanabe[9] 和Jonker[10] 建立了
TaqMan MAG 探針多重Real-Iime PCR
體系對(duì)混合豬肉、雞肉、牛肉、和馬
肉等肉制品同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)。該技
術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)食品品質(zhì)和真?zhèn)蔚臋z測(cè)和鑒
定，以便有效的辨別真?zhèn)?。但要注意?
采用該技術(shù)對(duì)肉類成分鑒別通常為排
除法或反向鑒定，如在商家聲稱為驢
肉的產(chǎn)品中檢出豬肉成分，證明該商
家以次充好，從而保護(hù)消費(fèi)者的知情
權(quán)和選擇權(quán)。
4 食品真?zhèn)舞b定
DNA 作為每一個(gè)物種獨(dú)一無(wú)二的
身份證明，我們可以借助物種特異性
靶基因逆向思維對(duì)可能摻假的成分進(jìn)
行鑒定，采用核酸檢測(cè)方法進(jìn)行制假
和鑒假的博弈。中秋將至，有些不法
商販?zhǔn)芾骝?qū)使，以低成本的蕓豆
或冬瓜冒充蓮蓉，GBT 23814-2009
通過常規(guī)PCR 方法檢測(cè)蓮蓉餡中蓮
子NNEA0732 和蕓豆AB070627 內(nèi)參基
因，從而判斷蓮蓉餡月餅中是否含有
蕓豆成分，而我們實(shí)驗(yàn)室在此標(biāo)準(zhǔn)基
礎(chǔ)上成功研制蓮蓉制品中蕓豆成分的
TaqMan 實(shí)時(shí)熒光PCR 方法, 并針對(duì)蓮
蓉中淀粉成分多核酸成分少的弊端對(duì)
核酸前處理步驟進(jìn)行了優(yōu)化，核酸得
率和純度較高。目前正在研制鑒定冬
瓜的TaqMan Real-Time PCR 方法。而
蜂蜜造假是長(zhǎng)期以來(lái)關(guān)注的問題，目
前認(rèn)為SM-R 大米糖漿、β- 呋喃果糖
苷酶、碳四植物糖和薄層色譜鑒定高
果糖漿四種指標(biāo)可推薦為蜂蜜真實(shí)性
檢測(cè)指標(biāo)，檢出陽(yáng)性者可懷疑含有摻
假成分。目前江蘇出入境研制的辨別
蜂蜜中大米糖漿的實(shí)時(shí)熒光PCR 法已
通過審定，通過鑒定大米內(nèi)參基因 而
判斷蜂蜜中是否摻入大米糖漿。而借
助這種思維，對(duì)地溝油中動(dòng)物性成分
檢測(cè)可能為地溝油的鑒別提供另一種
思路。
5 食品過敏原成分檢測(cè)
食品過敏原問題也是威脅健康的
重要問題，逐漸引起社會(huì)關(guān)注。食源
性過敏源常發(fā)生于過敏體質(zhì)人群，主
要由IgE 免疫球蛋白介導(dǎo)的Ⅰ型超敏
反應(yīng)，嚴(yán)重者會(huì)威脅生命。對(duì)過敏體
質(zhì)人群來(lái)說(shuō)，主要是外源蛋白都可引
起反應(yīng)，所以食源性過敏原類別具有
個(gè)體特異性[11]。常見于畜禽類、水產(chǎn)
品類、堅(jiān)果類、水果類、農(nóng)產(chǎn)品類和
雞蛋牛奶蛋白類等蛋白含量高的食品。
基于核酸的過敏原檢測(cè)選取物種特異
性基因作為靶基因，如編碼大豆植物
凝集素Lectin 基因、編碼玉米植物醇
溶蛋白ZEIN 基因、編碼油菜磷酸烯醇
式丙酮酸羧化酶PE3-PEPcase 基因和
編碼馬鈴薯蔗糖合成酶SSG 基因等；
SN/T 1961.2-2007 建立了檢測(cè)食品中
花生成分過敏原的實(shí)時(shí)熒光PCR 方法；
Tanabe 等建立了PCR 技術(shù)，用來(lái)驗(yàn)證
標(biāo)簽中標(biāo)識(shí)的過敏原成分和鑒定深加
工食品組分的中隱性過敏原成分。但
要注意，由于機(jī)體的過敏活性由蛋白
空間構(gòu)象介導(dǎo)，單純檢測(cè)核酸只能說(shuō)
明該食物中可能存在致敏成分，如果
蛋白被破壞也可能檢測(cè)到核酸成分。
6 轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)
轉(zhuǎn)基因作物因其抗蟲、抗病毒、
耐除草劑能力增強(qiáng)，從而提高產(chǎn)量、
增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或食物品質(zhì)而被廣泛用
于全世界的食品。全世界批準(zhǔn)投入商
品化轉(zhuǎn)基因作物達(dá)幾十種，包括美國(guó)
孟山都公司(Monsanto) GTS40-3-2 和
MON89788 大豆，MON810、MON863、
MON88017 和NK603 玉米，GT73 油菜，
15985BollgardII 保鈴棉、MONey88913
抗農(nóng)達(dá)Flex 棉花、1445 抗農(nóng)達(dá)棉和
140 食品安全導(dǎo)刊 2015年7月
Technology
科技
科技文苑
531 抗蟲棉，H7-1 抗農(nóng)達(dá)甜菜； 瑞
士先正達(dá)（Syngenta） 公司Bt176、
Bt11、MIR604 玉米；美國(guó)陶氏益農(nóng)、
杜邦先鋒育種公司TC1507、59122
玉米； 德國(guó)拜耳A2704-12 大豆，
T25、T45、Topas19/2、Oxy-235 和
Ms1Rf1-3 油菜，LLCOTTON25 棉花。
農(nóng)業(yè)部公布數(shù)據(jù)顯示，自2004 年以來(lái)，
我國(guó)獲得審批進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品達(dá)
79 批。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的
安全性存在爭(zhēng)議，各國(guó)法律法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)
基因食品的種植、食用及進(jìn)出口都有
嚴(yán)格要求，我國(guó)《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管
理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管
理辦法》對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)簽標(biāo)識(shí)也
有明確規(guī)定。
民眾對(duì)轉(zhuǎn)基因食品知情權(quán)和選擇
權(quán)、法律法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的要求以
及食品安全監(jiān)管的責(zé)任要求我們能從
類別繁多、成分復(fù)雜的食品中快速篩
查并鑒定出是否有轉(zhuǎn)基因成分（篩選
基因檢測(cè)），為何種轉(zhuǎn)基因成分（基
因特異性檢測(cè)）并能準(zhǔn)確鑒定出其品
種品系（品種特異性檢測(cè)）。目前轉(zhuǎn)
基因產(chǎn)品檢測(cè)為篩選、定性和鑒定三
步驟。第一步篩選檢測(cè)：即通過檢測(cè)
大部分轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中插入的公共基因
元件如CaMV35S、FaMV35S 啟動(dòng)子、
NOS 終止子、標(biāo)記基因NPT Ⅱ、Bar 或
PAT 基因初步判斷是否有轉(zhuǎn)基因成分，
通用元件和標(biāo)記基因通常用于初篩，
幾乎無(wú)特異性。但由于不同商品化品
種插入的公共基因元件的類型和組合
方式不同，單個(gè)基因初篩存在假陰性，
而初篩為陰性就不進(jìn)行后面定性和鑒
定步驟了，容易導(dǎo)致漏檢。第二步定
性檢測(cè)：判斷轉(zhuǎn)入外源基因的類型，
初篩為陽(yáng)性，進(jìn)一步做基因特異性檢
測(cè)， 如來(lái)源Agrobacteriun sp CP4 菌
株的耐受草甘膦類除草劑的CP4-EPSPS
基因，來(lái)源Bucillus thuringiensis 菌
株抗鞘翅目害蟲的cry3Bb1 基因等。
但由于相同的基因特異性基因可能在
相同或不同的植物中表達(dá)形成新的具
有相同農(nóng)藝性狀的品系或新的轉(zhuǎn)基因
植物，因此基因特異性檢測(cè)方法不能
特異性的區(qū)分具有相同農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)
基因植物及其品系，在建立基因特異
性檢測(cè)的同時(shí)還需引用其他基因進(jìn)行
輔助。第三步鑒定檢測(cè)：判斷轉(zhuǎn)基因
產(chǎn)品的品種品系，即品系特異性檢測(cè)。
通過檢測(cè)外源插入載體與植物基因組
的連接區(qū)序列實(shí)現(xiàn)，如BT11 品系鑒定
基因cry1A(b) 與adh1-IVS6 邊界序列、
GA21 品系OTP 與EPSPS 邊界序列以及
T25 品系鑒定CaMV35S 與PAT 邊界序列
等。由于每一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品系都具
有特異的外源插入載體與植物基因組
的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單
拷貝，所以品系特異性檢測(cè)方法具有
較高的特異性和準(zhǔn)確性。
因此選擇合適的篩查和鑒定方法
是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)亟待解決的問題。
我們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品現(xiàn)行
有效方法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初略統(tǒng)計(jì)，主要有
GB/T 19495-2004 系列8 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)、SN
普通定性和熒光定量標(biāo)準(zhǔn)19 個(gè)，農(nóng)
業(yè)部涉及安全評(píng)估和定性定量檢測(cè)標(biāo)
準(zhǔn)20 個(gè)以及農(nóng)業(yè)部869 號(hào)、953 號(hào)、
1193 號(hào)和1485 號(hào)公告共60 余個(gè)標(biāo)
準(zhǔn)，但這些方法多為某一具體品系單
重PCR 鑒定，難以滿足對(duì)大量未知信
息樣品的快速篩查要求。100 多個(gè)標(biāo)
準(zhǔn)中， 僅GB/T 19495.5-2004、SN/T
1204-2003、SN/T 1943-2007 和SN/
T 2584-2010 等少數(shù)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)為Real-
Time PCR, 其他多數(shù)為傳統(tǒng)PCR 方法，
需要凝膠電泳等后處理步驟，耗時(shí)且
不同同時(shí)篩查多個(gè)基因，無(wú)法滿足快
速、準(zhǔn)確篩查和鑒定的目的。而多重
PCR 方法可以擔(dān)當(dāng)此重任，但快速和準(zhǔn)
確的關(guān)鍵是對(duì)聯(lián)合的靶基因的選擇。
有報(bào)道借鑒管理學(xué)上的“矩陣法”根
據(jù)商品化轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的基因分布特
點(diǎn)，篩選出合適的組合基因。而也有
多篇文獻(xiàn)報(bào)道，聯(lián)合初篩基因組合如
CaMV35S、NOS、FaMV35S 和Bar 進(jìn)行四
重PCR 轉(zhuǎn)基因篩查策略。但是，由于
不同作物使用的基因元件和外源基因
的種類和頻次各不相同，因此不同作
物需根據(jù)具體情況采取合適的篩查策
略，本實(shí)驗(yàn)室目前正在進(jìn)行這方面的
研究工作。
7 挑戰(zhàn)和展望
食品檢測(cè)技術(shù)的迅猛發(fā)展，既為食
品檢測(cè)方法提供機(jī)遇，也帶來(lái)了巨大的
挑戰(zhàn)。由于食品的種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜、
影響和干擾因素多，且食品檢測(cè)中的靶
基因類別繁多：原核生物、真核生物；
細(xì)菌、病毒、寄生蟲；動(dòng)物成分、植物
成分；原材料食品、加工和深加工食品
等，而食品中檢測(cè)的核酸多為痕量，這
些都給獲得高質(zhì)量和高純度的核酸帶來(lái)
挑戰(zhàn)，而核酸質(zhì)量的好壞決定PCR 檢測(cè)
的成敗，所以選擇合適的核酸提取和純
化方式至關(guān)重要。
核酸的提取原則是將核酸與蛋白
質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分
開，且在提取過程中保證核酸分子一
級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性并排除其他物質(zhì)的污
染和干擾。大多數(shù)核酸分離純化一般
July 2015 CHINA FOOD SAFETY 141
科技文苑
為細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生
物大分子分離、核酸純化等幾個(gè)主要
步驟，每一步驟又可由多種不同的方
法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。目前常用的有物
理裂解法，如顆粒勻漿法、液氮研磨、
超聲裂解、微波裂解等；化學(xué)裂解法，
如CTAB 法、PVP 法；酶法，如溶菌酶
或蛋白酶K 破壁，且分解蛋白釋放核
酸。然后根據(jù)核酸和待分離物質(zhì)理化
性質(zhì)的差異, 用選擇性沉淀法，如酚-
氯仿法、胍- 氯仿法；層析法，如磁
珠、玻璃、硅土或硅膠等固相載體選
擇性吸附而將核酸分離和純化。目前
磁珠法提取核酸因其得率高、純度好、
成本低、快速、簡(jiǎn)便、節(jié)省人力以及
易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。
但是，具體實(shí)驗(yàn)中選擇哪種或哪幾種
核酸提取方式，要根據(jù)細(xì)胞類型、待
提取的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康木C合
考慮。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)結(jié)合設(shè)立的從提
取到擴(kuò)增全過程對(duì)照系統(tǒng)和對(duì)核酸純
度、濃度、完整性和質(zhì)量評(píng)估的評(píng)價(jià)
體系，從操作和評(píng)價(jià)兩個(gè)層面共同保
證核酸提取質(zhì)量滿足特異和準(zhǔn)確PCR
檢測(cè)的需要。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行的定量檢測(cè)
還不能實(shí)現(xiàn)真正意義的絕對(duì)定量，我們
現(xiàn)在對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR 數(shù)據(jù)處理的Livak
法即2- △△ CT 法、用參照基因歸一的
△ Ct 法以及Pfaffl 法都是基于“歸一
化”數(shù)學(xué)思想建立的依賴Ct 值的相對(duì)
定量。但是，目前研制的第三代微滴式
數(shù)字PCR 系統(tǒng)（Droplet Digital PCR）
能實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量，靶序列
的起始濃度不再依賴Ct 值，而是直接
給出。該系統(tǒng)系統(tǒng)主要由微滴發(fā)生器和
微滴分析儀組成。微滴發(fā)生器（droplet
generator）將含有核酸分子的反應(yīng)體
系形成成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，其中
每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者
含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子，且每
個(gè)微滴都作為一個(gè)獨(dú)立的PCR 反應(yīng)器。
經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，采用微滴分析儀（droplet
reader）逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有
熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒有熒光信
號(hào)的微滴判讀為0（因此該技術(shù)被稱為
數(shù)字PCR），最終根據(jù)泊松分布原理以
及陽(yáng)性微滴的比例，分析軟件可計(jì)算出
待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)。
數(shù)字PCR 為絕對(duì)定量，乃至食品檢
測(cè)提供了一種全新的技術(shù)思路與手段，
隨著人類對(duì)更多生物體的測(cè)序完成，
我們對(duì)地球上更多生命體生物信息的了
解，相信我們對(duì)食品生物安全的鑒定、
鑒別、監(jiān)測(cè)和評(píng)估會(huì)上升一個(gè)新的臺(tái)階。
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作者簡(jiǎn)介：竇麗芳（1980-），女，
碩士，工程師。研究方向：食品微生
物及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究以及實(shí)
驗(yàn)室管理和標(biāo)準(zhǔn)體系。

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