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酶抑制分光光度法與表面增強(qiáng)拉曼散射在農(nóng)藥檢測中的進(jìn)展

文檔作者：翁士狀李淼李華龍羅偉文檔來源：中國科學(xué)院合肥智能機(jī)械研究所		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2025年07月20日
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第6 卷 第9 期 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào) Vol. 6 No. 9
2015 年9 月 Journal of Food Safety and Quality Sep. , 2015
基金項(xiàng)目: 國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863 計(jì)劃”) (2013AA102302)
Fund: Supported by National High-tech R&amp;amp;D Program of China (863 Program) (2013AA102302)
*通訊作者: 李淼, 研究員, 博士生導(dǎo)師, 主要研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)信息化。E-mail: mli@iim.ac.cn
*Corresponding author: LI Miao, Professor, Hefei Institute of Intelligent Machines, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China.
E-mail: mli@iim.ac.cn
酶抑制分光光度法與表面增強(qiáng)拉曼散射在
農(nóng)藥檢測中的進(jìn)展
翁士狀, 李 淼*, 李華龍, 羅 偉
(中國科學(xué)院合肥智能機(jī)械研究所, 合肥 230031)
摘要: 實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測, 對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和人民生命健康具有重要意義。本文針對有機(jī)磷
農(nóng)藥快速檢測中的酶抑制分光光度法和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SERS)分別就研究進(jìn)展、應(yīng)用情況以及面臨的
問題進(jìn)行綜述, 旨在為后續(xù)有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測的研究人員提供技術(shù)與應(yīng)用參考。酶抑制分光光度法可對樣品
中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留總量做粗略估計(jì), 主要應(yīng)用于大量樣品進(jìn)行快速篩選, 但在檢測過程中, 存在酶活性一致性
差、易受檢測對象干擾以及檢測環(huán)境嚴(yán)格等缺點(diǎn)。SERS 技術(shù)具有指紋特性、檢測速度快、檢測成本低以及檢
測精度高等優(yōu)點(diǎn), 可對樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速定性定量分析, 具有巨大的應(yīng)用潛力。當(dāng)然, 作為新
興分析手段, 在重復(fù)與穩(wěn)定性上仍面臨一些問題。
關(guān)鍵詞: 酶抑制分光光度法; 表面增強(qiáng)拉曼散射; 有機(jī)磷農(nóng)藥; 快速檢測
Progress of enzyme inhibition spectrophotometry and surface enhanced
Raman scatter for detection of pesticides
WENG Shi-Zhuang, LI Miao*, LI Hua-Long, LUO Wei
(Hefei Institute of Intelligent Machines, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China)
ABSTRACT: Rapid detection of organophosphorus pesticide is of great significance for the quality and safety
of agricultural products and the people's health. This paper summarized the research progress, application
situation and problems of enzyme inhibition spectrometry and surface enhanced Raman scatter (SERS)
technology, which aimed to provide the technology and application reference on the detection of
organophosphorus pesticide for the subsequent researchers. The enzyme inhibition spectrophotometry is for the
rough and total estimate of the organophosphorus pesticide residues and realizes to a large number of the
samples. But it has the shortcomings of the poor consistency of the enzyme activity and stringent testing
environment, and it is also susceptible to some objects. SERS has the advantages of fingerprint characteristics,
high detection speed and precision, and low cost into consideration, it has great potential for the qualitative and
quantitative analysis for pesticide residues in the samples. However, as a new analysis method, it is still faced
with some problems of the repetition and stability.
KEY WORDS: enzyme inhibition spectrophotometry; surface enhanced Raman scatter; organophosphorus
pesticide; rapid detection
3576 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào) 第6 卷
1 引 言
農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的生產(chǎn)資料, 在保證農(nóng)
業(yè)產(chǎn)量、減少農(nóng)業(yè)損失方面發(fā)揮重要作用。但隨著農(nóng)藥的
大量不合理使用, 其所造成的環(huán)境污染以及對人體身體健
康的危害, 越來越受到人們的高度關(guān)注和重視, 探索合適
的農(nóng)藥檢測技術(shù)是現(xiàn)階段亟需解決的。農(nóng)藥施用中, 有機(jī)
磷農(nóng)藥所占比重最大[1], 本文將討論有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢
測方法。
常見有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的實(shí)驗(yàn)室檢測方法包括氣相色
譜法(GC)[2]、高效液相色譜法(HPLC)[3,4]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)
譜法(GC-MS)[5]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)[6]等。它們具
有分離效能高、靈敏度高、重復(fù)性好、選擇性高等優(yōu)點(diǎn), 發(fā)
展成熟, 現(xiàn)已被國家規(guī)定為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。當(dāng)然, 上述方法
也存在一些缺點(diǎn), 比如說前處理繁瑣、分析具有破壞性、
試劑消耗大、耗時(shí)長、成本高, 同時(shí)分析所用的儀器昂貴
且龐大、笨重, 只適用于抽樣檢測。
我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中, 種植基地、批發(fā)市場、超市、海關(guān)
等生產(chǎn)流通環(huán)節(jié), 都需要進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測。因
此, 如何實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測是研究工作重點(diǎn)
方向。在農(nóng)藥快速檢測中, 酶生物與光譜檢測技術(shù)[7]顯示
出獨(dú)特的優(yōu)越性, 具體包括酶制劑速測卡法、酶抑制分光
光度法、酶聯(lián)免疫法[8]、酶生物傳感器法[9,10]、近中紅外光
譜法[11,12]、熒光光譜法[13,14]和拉曼光譜法等[15-17]?，F(xiàn)階段,
酶抑制分光光度法是應(yīng)用最為廣泛的有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測
方法; 而在拉曼光譜基礎(chǔ)上發(fā)展而來的表面增強(qiáng)拉曼散射
(SERS)技術(shù)由于其高探測靈敏度、高分辨率、水干擾小、
可猝滅熒光等優(yōu)點(diǎn), 在農(nóng)藥殘留快速檢測方面擁有巨大的
應(yīng)用潛力。本文將針對上述2 種方法檢測原理、應(yīng)用情況
及面臨問題方面進(jìn)行綜述, 為有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的
發(fā)展和應(yīng)用提供一定參考。
2 酶抑制分光光度法
2.1 酶抑制分光光度法檢測原理
酶抑制法檢測有機(jī)磷農(nóng)藥是基于有機(jī)磷農(nóng)藥對乙酰
膽堿酯酶活性的抑制作用, 通過測量酶促反應(yīng)速率(酶活
性)的變化進(jìn)而獲知農(nóng)藥殘留量。與分光光度法相結(jié)合則是
具體來測定溶液的顯色反應(yīng)來間接得到酶活性變化。合適
情況下, 乙酰膽堿酯酶水解底物-碘化硫代乙酰膽堿(BTCI)
或者硫代乙酰膽堿(AsCh), 產(chǎn)生硫代膽堿和乙酸, 然后,
硫代膽堿和顯色劑-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)產(chǎn)生顯色
反應(yīng), 使得反應(yīng)溶液呈現(xiàn)黃色, 然后用分光光度計(jì)測定
412 nm 處的吸光度變化值。對樣品中的農(nóng)藥殘留的檢測具
體過程是將乙酰膽堿酯酶和樣品提取液相混合, 并加入顯
色劑, 在適合水浴溫度下靜置一段時(shí)間后, 加入底物混勻
后, 測量固定時(shí)間內(nèi)的吸光度變化值。與此同時(shí), 需要檢測
空白樣品(只含有提取液)的相同時(shí)間內(nèi)吸光度變化。利用
下式計(jì)算出抑制率, 根據(jù)抑制率的大小判斷樣品中有機(jī)磷
農(nóng)藥殘留的情況。
1 2
1
100%
? ??
? ?
?
IR A A
A
IR 為抑制率(inhibition rate); ?A1為空白樣品吸光度
的變化值; ?A2 為被測樣品吸光度的變化值。
2.2 酶抑制分光光度法在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的應(yīng)用
利用酶抑制分光光度法來檢測有機(jī)磷農(nóng)藥, 相關(guān)學(xué)
者展開許多研究工作。侯明迪等[18]采用植物酯酶測定有機(jī)
磷農(nóng)藥-敵敵畏(DDVP)和甲基對硫磷的條件方法, 并采用
酶促反應(yīng)速率替代原來的反應(yīng)平衡時(shí)的吸光值來表示酶的
活性, 通過活化劑使甲基對硫磷對酶活性的抑制提高
50~100 倍, 其最小檢出濃度分別為0.01 mg/kg 和0.166
mg/kg。邱朝坤等[19]對酶抑制法快速檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留
進(jìn)行研究, 以鯽魚腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶為檢測用
酶, 對5 種蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測, 根據(jù)AChE
酶活抑制率和農(nóng)藥抑制方程, 判斷農(nóng)藥殘留情況。當(dāng)AChE
酶活抑制率大于35%時(shí), 可判斷該樣品中農(nóng)藥殘留超標(biāo),
該方法的回收率在80%~120%之間。此外, Jin 等[20]用酶抑
制法測定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥含量, 酶活力的抑制
率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān), 檢測方法對呋喃丹、西維因、
對氧磷、敵敵畏的檢測限分別是3.5、50、12 和25 μg/L, 該
檢測方法已用于蔬菜汁中呋喃丹的測定, 含不同濃度呋喃
丹大白菜汁的回收率在93.2%~107%之間, 油菜汁的回收
率在108%~118%之間。
現(xiàn)階段, 我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)民專業(yè)知識匱乏、農(nóng)藥過
量以及不合理施用頻率高, 導(dǎo)致國內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留問題
日益突出。酶抑制分光光度法由于檢測成本低、快速及簡
單易操作, 被國家、農(nóng)業(yè)部規(guī)定為有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)
速測手段。使用酶抑制分光光度法檢測有機(jī)磷農(nóng)藥, 具有
以下優(yōu)點(diǎn): 樣品前處理簡單, 檢測過程快速, 每份樣品從
前處理到確認(rèn)最終檢測結(jié)果只需要30 min 左右, 能很快確
認(rèn)高殘留的果蔬, 有效防止其流入市場造成中毒事件, 適
用于基層農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管機(jī)構(gòu); 單次檢測的費(fèi)用較低,
可以對大范圍的果蔬樣品進(jìn)行初篩, 與實(shí)驗(yàn)室精確分析手
段-氣相色譜等方法結(jié)合可構(gòu)建完善的農(nóng)藥殘留監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)。
不可避免地, 該方法也存在一些問題。首先, 檢測過
程中酶試劑的活性不易精確控制, 檢測結(jié)果差異明顯, 重
復(fù)性差。其次, 由于酶抑制方法是針對有機(jī)磷和氨基甲酸
酯2 大類農(nóng)藥, 不具有選擇性, 對農(nóng)藥種類與具體含量方
面就無法確認(rèn)。再者, 基于本方法對各種農(nóng)藥的檢出限偏
高, 多數(shù)情況下, 無法達(dá)到國家對果蔬中最大農(nóng)藥殘留量
的限定值。此外, 在檢測過程中, 芹菜、韭菜、洋蔥、番茄
第9 期 翁士狀, 等: 酶抑制分光光度法與表面增強(qiáng)拉曼散射在農(nóng)藥檢測中的進(jìn)展 3577
及菌類等蔬菜汁液中, 含有對酶有影響的植物次生物質(zhì),
如氯代煙堿類, 易造成假陽性結(jié)果, 建議采用整株(或大
塊蔬菜)浸提的前處理。當(dāng)然, 一些顏色比較深的樣品, 在
檢測中也存在干擾, 宜多次過濾或使用活性炭吸附去除
色素干擾[21]。實(shí)驗(yàn)試劑的保存條件嚴(yán)格, 除緩沖液外, 乙
酰膽堿酯酶、顯色劑、底物都必須在合適的溫度下儲存,
一般建議是在0~4 ℃左右, 而且不宜長時(shí)間放置或反復(fù)
凍化[22]。
3 表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)
3.1 表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)檢測原理
表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)是源自于拉曼散射光譜。拉曼
散射光譜是印度物理學(xué)家Raman 于1928 年發(fā)現(xiàn)的[23]。單
色光照射在分子表面會發(fā)生散射, 部分散射光由于與物質(zhì)
分子間發(fā)生非彈性碰撞, 進(jìn)行能量交換。散射光與原始激
發(fā)的單色光的波長發(fā)生改變, 所形成的就是拉曼光譜。光
譜中尖銳的峰表征了物質(zhì)分子間的振動(dòng)與轉(zhuǎn)動(dòng)信息, 拉曼
光譜具有指紋特征, 不同物質(zhì)具有不同拉曼光譜特征峰,
因此, 拉曼光譜可用于物質(zhì)的分析與檢測。但常規(guī)拉曼散
射截面較小, 拉曼散射的靈敏度較低, 嚴(yán)重制約拉曼光譜
在物質(zhì)分析檢測中的應(yīng)用。1974 年Fleischmann 首次在吡
啶吸附的粗糙銀電極上觀察到拉曼散射效應(yīng)得到極大的增
強(qiáng), 此種現(xiàn)象被稱為表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)[24]。SERS
現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)有效地解決拉曼散射在分析檢測中低靈敏度問
題, 極大拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。
SERS 增強(qiáng)效應(yīng)體系非常復(fù)雜, 體系表面形貌和表面
電子結(jié)構(gòu)、光和粗糙表面的互相作用、光和分子的互相作
用、分子在表面的取向、成鍵作用以及分子和表面的周邊
環(huán)境、入射光的強(qiáng)度、頻率、偏振度和偏振方向等因素對
SERS 圖譜都存在較大影響, 這種復(fù)雜性導(dǎo)致人們對SERS
效應(yīng)增強(qiáng)機(jī)理還沒有一個(gè)統(tǒng)一而精確的認(rèn)識[25]。目前, 大
部分研究人員比較認(rèn)可的是電磁增強(qiáng)(EM)[26]和化學(xué)增強(qiáng)
(CT)[27]共同導(dǎo)致SERS 效應(yīng)的出現(xiàn)。電磁增強(qiáng)機(jī)理一般認(rèn)
為是入射激光與金屬粒子之間的互相作用形成等離子共振,
共振又會大大提高其表面局域電場強(qiáng)度, 繼而使入射光和
散射光電場都得到放大?；瘜W(xué)增強(qiáng)則是認(rèn)為是金屬、分子、
入射激光在近距離上的互相作用而引起的類共振, 使得散
射信號得到增強(qiáng)。
想獲取高質(zhì)量的SERS 信號, 增強(qiáng)基底的材料與結(jié)構(gòu)
是其中關(guān)鍵。一般來說, 較強(qiáng)的表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)只
在一些粗糙化貴金屬、堿性金屬或過渡金屬表面上出現(xiàn)。
其中, 貴金屬包括金、銀、銅等, 堿性金屬如鋰、鈉、鉀等
以及過渡金屬像鐵、鈷、鎳等。大量實(shí)驗(yàn)表明, 銀的拉曼
散射增強(qiáng)能力最強(qiáng), 金和銅次之。同時(shí), SERS 效應(yīng)對金屬
表面的粗糙度、襯底表面形貌和介電常數(shù)等也有著特殊要
求。因此, 選擇合適的表面增強(qiáng)基底制備方法是至關(guān)重要
的。目前, 主要制備方法包括電化學(xué)氧化還原法[28]、沉積
法[29]、化學(xué)刻蝕法[30]、金屬溶膠法[31]、平板印刷法、金屬
/氧化物核殼法[32,33]等, 上述方法制備的基底材料在增強(qiáng)性
能與重復(fù)性上仍存在一定問題。因此, 制備出增強(qiáng)性能優(yōu)
且重復(fù)性好基底材料是需要大力探索與研究的。
3.2 SERS 光譜在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的應(yīng)用
國內(nèi)外利用SERS 光譜檢測有機(jī)磷農(nóng)殘檢測方面取得
一定的進(jìn)展。吉芳英等[34]以金銀核殼粒子為基底獲得了不
同濃度及其酸堿條件下氧化樂果的SERS 光譜, 發(fā)現(xiàn)在酸
性環(huán)境下信號更好, 檢測限達(dá)到2×10-10 mol/L。葉冰等[35]
使用共焦顯微拉曼光譜儀采集臍橙表皮氧樂果的SERS 光
譜, 并用不同的光譜預(yù)處理方法結(jié)合偏最小二乘法(PLS)
建立分析模型, 分析RMSEP 為6.424 mg/L。筆者[36-38]在納
米銀溶膠顆?；A(chǔ)上, 同時(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了對
乙基對氧磷、敵瘟磷及甲基對硫磷的定性與定量分析, 檢
測限達(dá)到0.1 mg/L。Liu 等[28]采用外殼厚度不同的Au@Ag
核殼納米粒子, 檢測出水果表皮上的福美雙、毒死蜱、甲
基對硫磷等多種有機(jī)磷農(nóng)藥, 其中, 對水果表皮上福美雙
的檢測限為1.5 ng/cm2。Guerrini 等[39]測量了樂果和氧化樂
果的SERS 光譜, 最低可檢出的濃度達(dá)到10-5 mol/L。Li
等[40]利用動(dòng)態(tài)SERS 檢測技術(shù)完成對對氧磷、殺螟硫磷檢
出限為0.026、0.011 mg/L, 同時(shí)也測試了對上述2 種農(nóng)藥
的量化檢測限為0.042、0.016 mg/L。
SERS 光譜的檢測速度快、實(shí)際檢測成本低以及由于
光譜信號的極大增強(qiáng)后所形成的超高檢測精度, 使得其在
物質(zhì)檢測中凸顯出特別的優(yōu)勢, 非常適合有機(jī)磷農(nóng)藥超低
殘留的檢出應(yīng)用。同時(shí), SERS 技術(shù)還可與其他技術(shù)互補(bǔ)聯(lián)
用, 比如毛細(xì)管電泳[41]或色譜[42]聯(lián)用技術(shù), 來滿足農(nóng)殘檢
測中的復(fù)雜要求。一些研究人員還將SERS 增強(qiáng)材料組裝
到光纖上, 作為高靈敏度的檢測傳感器[43,44]?，F(xiàn)在, 光譜儀
生產(chǎn)廠家如HORIBA Scientific, Ocean Optics 已經(jīng)開發(fā)出
手持或光纖拉曼光譜儀, 為SERS 技術(shù)在農(nóng)藥現(xiàn)場檢測創(chuàng)
造了條件。在實(shí)際檢測中, SERS 技術(shù)也面臨一些問題與挑
戰(zhàn)。SERS 技術(shù)是依靠增強(qiáng)襯底對拉曼散射的極大增強(qiáng)來
達(dá)到的, 在檢測中被檢測樣就需要與增強(qiáng)基底進(jìn)行接觸,
這就使其喪失光譜檢測中的非接觸與侵入的優(yōu)點(diǎn)。而且,
處于基底不同位點(diǎn)上的增強(qiáng)作用存在差異, 同時(shí)信號強(qiáng)度
易受到激發(fā)波長、共振效應(yīng)、測量環(huán)境等外部條件影響[45],
檢測中SERS 信號的重復(fù)性與穩(wěn)定性較差, 不利于其在定
量分析中的應(yīng)用。雖然化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的引入會在一定程
度上提高SERS 光譜的定量分析能力, 問題并未從根本上
解決。但隨著SERS 機(jī)理的深入探索、納米材料的不斷發(fā)
展、光學(xué)組件性能的提升及化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的持續(xù)研究,
未來SERS 光譜的重復(fù)性與穩(wěn)定性將會得到大大的提高,
在有機(jī)磷農(nóng)藥以及其他物質(zhì)的定量檢測方面必將煥發(fā)新的
活力。
3578 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào) 第6 卷
4 結(jié) 論
本文主要討論了有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的2 種快速檢測方法:
酶抑制分光光度法、SERS 技術(shù)。酶抑制分光光度法應(yīng)用
于樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留總量的粗略估計(jì), 可對大量樣品
進(jìn)行快速篩選, 應(yīng)用最為廣泛。SERS 技術(shù)具有指紋特性、
檢測速度快、實(shí)際檢測成本低以及檢測精度高等優(yōu)點(diǎn), 可
對樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速定性定量分析, 具有
巨大的應(yīng)用潛力。作為新興分析手段, 在重復(fù)與穩(wěn)定性上
仍面臨一些問題, 需要進(jìn)一步深入研究與探索。當(dāng)然, 2 種
方法也可通過聯(lián)用來拓展在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用范
圍。
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(責(zé)任編輯: 李振飛)
作者簡介
翁士狀, 博士研究生, 主要研究方向
為農(nóng)業(yè)污染物檢測。
E-mail: 710382229@qq.com
李 淼, 研究員, 博士生導(dǎo)師, 主要
研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)信息化。
E-mail: mli@iim.ac.cn

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