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核酸適配體生物傳感技術(shù)在食品污染物檢測中的應(yīng)用

文檔作者：梁剛滿燕李安潘立剛文檔來源：北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(北京) 農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2025年06月15日
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第8 卷 第8 期 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào) Vol. 8 No. 8
2017 年8 月 Journal of Food Safety and Quality Aug. , 2017
基金項(xiàng)目: 北京市農(nóng)林科學(xué)院院創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX20170420)、國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估重大專項(xiàng)子課題(GJFP201701403)
Fund: Supported by Special Projects of Construction of Science and Technology Innovation Ability of Beijing Academy of Agriculture and
Forestry Sciences (KJCX20170420) and National Major Projects of Risk Assessment of Agricultural Product Quality and Safety
(GJFP201701403)
*通訊作者: 潘立剛, 研究員, 博士, 主要研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail: panlg@nercita.org.cn
*Corresponding author: PAN Li-Gang, Professor, Ph.D, Beijing Research Center for Agricultural Standards and Testing, Beijing Academy of
Agriculture and Forestry Science, Beijing 100097, China. E-mail: panlg@nercita.org.cn
核酸適配體生物傳感技術(shù)在食品污染物
檢測中的應(yīng)用
梁 剛, 滿 燕, 李 安, 潘立剛*
(北京市農(nóng)林科學(xué)院, 北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(北京),
農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100097)
摘要: 核酸適配體生物傳感技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一種新的檢測技術(shù), 具有靶向性強(qiáng)、靈敏度高、價(jià)格
低廉等優(yōu)點(diǎn), 被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析、食品分析等領(lǐng)域。其中, 在食品分析領(lǐng)域主要體
現(xiàn)在農(nóng)殘、重金屬、食品添加劑以及生物毒素等檢測方面。本文首先介紹了核酸適配體的概念、篩選方法、
核酸適配體傳感器優(yōu)點(diǎn), 重點(diǎn)從傳感器的設(shè)計(jì)、傳感檢測原理、檢測性能等方面綜述了核酸適配體生物傳感
器在Pb2+、農(nóng)殘等食品污染物檢測中的應(yīng)用; 最后對核酸適配體生物傳感器的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。
關(guān)鍵詞: 食品安全; 適體; 生物傳感器; 重金屬; 農(nóng)藥
Applications of aptamer-based biosensing technology in the detection of food
contaminants
LIANG Gang, MAN Yan, LI An, PAN Li-Gang*
(Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing Research Center for Agricultural Standards and
Testing, Risk Assessment Lab for Agro-products(Beijing), Ministry of Agriculture, Beijing Municipal Key
Laboratory of Agriculture Environment Monitoring, Beijing 100097, China)
ABSTRACT: Aptamer-based biosensing technology is a new detecting technique in recent years with the advantages
of good target ability, high sensitivity and low cost, etc, which has been widely applied in the pharmaceutical industry,
biology and medicine, environmental analysis and food analysis. For food analysis, aptamer-based biosensing
technology is mainly used for detection of pesticide residues, heavy metals, food additives and biotoxin. This paper
introduced the concept of aptamer, screening methods and the advantages of aptamer sensor firstly, and then
emphatically reviewed the applications of aptamer sensor for the detection of food contaminants of Pb2+ and pesticide
residues from the points of conception of the sensor, sensening principle and detection performance. Finally, the
development trends of the aptamer sensor in the future were prospected.
KEY WORDS: food safety; aptamer; biosensor; heavy metal; pesticide
萬方數(shù)據(jù)
第8 期 梁 剛, 等: 核酸適配體生物傳感技術(shù)在食品污染物檢測中的應(yīng)用 2937
1 引 言
食品安全問題是關(guān)系國計(jì)民生的重大問題。重金屬、
農(nóng)藥、生物毒素等有毒有害物質(zhì)是食品的重要污染源, 進(jìn)
入人體后可對人體產(chǎn)生毒害作用, 誘發(fā)疾病或癌癥等, 因
此建立簡單、快速、靈敏的檢測方法, 可以有效避免人們
食用受污染食品, 具有重要的研究意義。
目前, 檢測重金屬離子采用的主要方法是原子熒光
法[1]、原子吸收法[2]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[3]、
電感耦合等離子體質(zhì)譜[4]等方法; 而農(nóng)藥、生物毒素、食
品添加劑等污染物的檢測主要是采用液相色譜、液相色譜-
質(zhì)譜聯(lián)法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[5-11], 這些方法可以
準(zhǔn)確定量目標(biāo)污染物的含量, 但也在一些不足, 如設(shè)備昂
貴、檢測費(fèi)用高、便攜性差、樣品前處理時(shí)間長及過程煩
瑣、需專門技術(shù)人員操作、不能實(shí)現(xiàn)在線檢測等, 這也限
制了分析工作中追求的實(shí)時(shí)、快速、野外現(xiàn)場檢測方法的
需求。市場上雖然也有定性和定量的快速農(nóng)藥殘留檢測方
法, 但這些方法也存在一些致命缺陷, 如指示劑法準(zhǔn)確性
差, 用于定性檢測的可信度不夠, 不易推廣; 紫外檢測儀
的儀器價(jià)格和配套試劑盒價(jià)格太貴, 不利于日常農(nóng)貿(mào)市場
上農(nóng)產(chǎn)品中殘留農(nóng)藥的監(jiān)測。此外, 針對生物毒素快速檢
測也有ELISA 試劑盒研究報(bào)道, 但是目標(biāo)毒素抗體篩選過
程需要投入較多資金和較長時(shí)間, 抗體制備難度較大, 易
失活、對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定的交叉反應(yīng)、只適用于
單一目標(biāo)的檢測分析等問題, 也限制了基于抗原抗體反應(yīng)
原理的檢測技術(shù)的發(fā)展。生物傳感器因其制備簡單、檢測
快速、價(jià)格低廉、穩(wěn)定重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)得到迅速的發(fā)展并
被廣泛應(yīng)用于疾病診斷[12,13]、病毒檢測、生物技術(shù)[14]、環(huán)
境分析[15,16]、食品分析[17,18]等領(lǐng)域。特別是對靶標(biāo)物具有
高親合力、特異性的核酸適配體DNA 的出現(xiàn)及適配體篩
技術(shù)的發(fā)展, 核酸適配體生物傳感技術(shù)在食品污染物分析
中引起了科研工作者極大的興趣, 展示了廣闊的應(yīng)用前景,
成為當(dāng)前的食品安全分析的研究熱點(diǎn)。
本文綜述了適體DNA 生物傳感技術(shù)在食品污染物分
析中的應(yīng)用, 重點(diǎn)介紹了適體DNA 生物傳感器對重金屬
Pb2+、農(nóng)藥等食品污染源的檢測研究, 最后對適體DNA 生
物傳感器的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。
2 核酸適配體生物傳感器
2.1 核酸適配體
適配體(aptamer)是從合成的DNA、RNA 文庫中經(jīng)指
數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands
by exponential enrichment, SELEX)篩選獲得能與靶物質(zhì)(蛋
白、核酸或其他小分子)高特異性、高親合力結(jié)合的單鏈寡
核苷酸序列[19]。該技術(shù)最初由美國的Szostak、Therk 等研
究小組分別報(bào)道[20]。在過去的幾十年中, SELEX 技術(shù)得到
了突飛猛進(jìn)的發(fā)展, 篩選得到了大量能與小分子、核酸、
蛋白甚至整個(gè)細(xì)胞均有高親合力、特異性的適體序列。
2.2 核酸適配體生物傳感器
核酸適配體生物傳感器(aptamer-based biosensors)是
以適配體(aptamer) 為分子識別物質(zhì), 以與目標(biāo)物的特異
性作用引起的直接或間接信號變化對目標(biāo)分子進(jìn)行檢測的
傳感器。到目前為止, 適配體傳感器實(shí)現(xiàn)了對農(nóng)殘、POPs
污染物、抗生素、重金屬、生物毒素等的檢測[21-29]。
核酸適配體生物傳感器具有以下優(yōu)點(diǎn): (l) 適配體與
目標(biāo)分子的結(jié)合具有高特異性和高親合力, 適配體與目標(biāo)
分子間的解離常數(shù)一般為10-9~10-12 mol[19]。(2) 目標(biāo)分子
范圍廣。適體不僅可以與酶、抗體等分子結(jié)合, 而且也可
以與金屬離子、生物毒素、藥物等小分子結(jié)合。(3) 廉價(jià)
易得, 重現(xiàn)性好, 易標(biāo)記。篩選出的適體可以通過化學(xué)合
成生產(chǎn), 純度高、組成確定, 消除了制備的批間誤差, 較單
抗制備更快速、更廉價(jià)。(4)分子量小。適配體一般是由
25~90 個(gè)堿基組成的單鏈寡核昔酸片段[30], 與目標(biāo)分子結(jié)
合空間位阻小, 從而有利于構(gòu)建高密度陣列傳感器。(5) 穩(wěn)
定性好, 可復(fù)性強(qiáng)。相對于酶和抗體/抗原, 適配體不僅具
有良好的穩(wěn)定性, 而且可反復(fù)變性、復(fù)性, 進(jìn)行重復(fù)利用。
這有利于提高生物傳感器的壽命和降低了傳感器的成本。
3 食品污染物核酸適配體生物傳感器研究及
應(yīng)用
3.1 Pb2+核酸適配體生物傳感器
3.1.1 Pb2+-DNA 酶核酸適配體
Pb2+核酸適配體主要包括2 類: Pb2+-DNA 酶、富G 堿
基DNA 序列。Pb2+-DNA 酶通常由酶鏈和底物鏈組成, 二
者可以部分互補(bǔ)雜化成雙鏈結(jié)構(gòu), 在Pb2+離子的作用下,
底物鏈的特定識別位點(diǎn)被切斷, 斷裂成兩部分的底物鏈與
酶鏈雜化的穩(wěn)定性降低, 因而使底物鏈和酶鏈解鏈, 基于
DNA 酶與Pb2+離子的這種特異性作用, 發(fā)展了Pb2+選擇性
生物傳感器。
Li 等[31]首次設(shè)計(jì)了Pb2+-DNA酶熒光生物傳感器實(shí)現(xiàn)
了對Pb2+的高靈敏、選擇性檢測, 檢測限1×10-8 mol/L。除
將熒光信號分子標(biāo)記于DNA 鏈, 有些有機(jī)分子在水溶液
自由態(tài)或與單鏈DNA 鏈作用、雙鏈DAN 發(fā)生作用后熒光
信號差異較大[32], 如熒光核酸染料PG 分子與單鏈DNA作
用后只有較弱的熒光信號, 而與雙鏈DNA 發(fā)生作用后可
以產(chǎn)生顯著的熒光信號, 基于此Zhang 等[33]設(shè)計(jì)了無標(biāo)記
sinal-off 型熒光生物傳感器實(shí)現(xiàn)了對Pb2+的檢測, 檢測限
1×10-8 mol/L; 溶液中的鋅卟啉分子與單鏈/雙鏈DNA 作用
較弱后只有較弱的熒光信號, 但是可以與G-四聯(lián)體DNA
結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性作用, 基于此Fu 課題組報(bào)道了一種基于
萬方數(shù)據(jù)
2938 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào) 第8 卷
Pb2+-DNA 酶循環(huán)作用信號放大熒光生物傳感器, 基于熒
光信號的變化實(shí)現(xiàn)了對Pb2+的高靈敏定量分析[34], 檢測限
3×10-9 mol/L。
相對于熒光傳感方法, 比色法具有可以直接通過肉
眼觀察到顏色變化而無需采用儀器檢測的優(yōu)點(diǎn)更有利于實(shí)
現(xiàn)野外樣品的的原位、實(shí)時(shí)檢測。研究表明, 金納米粒子
具有較高的消光系數(shù)且在不同聚集態(tài)時(shí)產(chǎn)生不同的顏色變
化[35,36], 因此以DNA-金納米粒子體系作為比色傳感器的
信號探針被廣泛用于生物分析領(lǐng)域。Liu 等[37]設(shè)計(jì)了第一
個(gè)Pb2+-DNA 酶-金納米粒子比色法生物傳感器實(shí)現(xiàn)了對
Pb2+的檢測, 檢測限1×10-7 mol/L。然而上述比色法檢測過
程需要2 h, 因此存在費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。Liu 等[38]對DNA 酶-金
納米粒子比色法生物傳感器進(jìn)行了改進(jìn), 優(yōu)化了DNA 酶
鏈長度、金納米粒子大小等, 將檢測時(shí)間縮短到10 min, 最
終實(shí)現(xiàn)了對Pb2+的快速檢測。此外, 基于單、雙鏈DNA 與
金納米粒子作用強(qiáng)弱的差異, Wei 等[39]設(shè)計(jì)了快速、靈敏、
無標(biāo)記Pb2+-DNA 酶-金納米粒子比色法生物傳感器實(shí)現(xiàn)了
對Pb2+的檢測, 檢測限5×10-7 mol/L。為提高比色法傳感器
監(jiān)測的靈敏度, Yun 等[40]在傳感器的設(shè)計(jì)中引入了分子信
標(biāo), 基于Pb2+-DNA 酶與分子信標(biāo)的循環(huán)作用實(shí)現(xiàn)了信號
放大, 實(shí)現(xiàn)了Pb2+的高靈敏檢測, 檢測限2×10-11 mol/L。
熒光及比色法雖然可以實(shí)現(xiàn)Pb2+的靈敏檢測, 但光信
號容易受到檢測體系共存物的干擾, 從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確
度。電化學(xué)方法具有靈敏度高、響應(yīng)快速、抗干擾性強(qiáng)等
優(yōu)點(diǎn)。采用電化學(xué)傳感法對Pb2+檢測通常需要電化學(xué)活性
分子標(biāo)記。如Plaxco 等[41]將亞甲基藍(lán)(methylene blue, MB)
分子標(biāo)記Pb2+-DNA 酶鏈, 設(shè)計(jì)并制備了用于檢測Pb2+的
電化學(xué)傳感器。當(dāng)傳感器與Pb2+共孵育60 min 時(shí)檢測限
3×10-7 mol/L。Shen 等[42]將納米金用于傳感器的制備, 納米
金表面修飾多條DNA 分子可以吸附更多的Ru(NH3)6
3+探
針增強(qiáng)電化學(xué)信號, 提高了檢測的靈敏度, 檢測限1×10-9
mol/L。Yang 等[43]設(shè)計(jì)了基于納米金顆粒信號放大的
Pb2+-DNA 酶生物傳感器, 實(shí)現(xiàn)了對Pb2+的高靈敏檢測, 檢
測限2.8×10-11 mol/L。量子點(diǎn)也可以實(shí)現(xiàn)電信號的放大, 因
此通過引入以量子點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)Pb2+的超高靈敏檢測。除此
之外, 電化學(xué)阻抗檢測技術(shù)具有高靈敏特點(diǎn), Shi 等[44]設(shè)計(jì)
了超高靈敏的Pb2+適配體傳感器, 檢測限1×10-13 mol/L。
3.1.2 富G 堿基DNA 序列
第2 類適配體是富G 堿基DNA 序列。一些富G 堿基
DNA 序列可與Pb2+發(fā)生特異性作用形成G-四鏈體結(jié)構(gòu),
Pb2+位于G-四鏈體結(jié)構(gòu)的兩個(gè)相鄰的G-四平面之間的空
腔處, 并與2 個(gè)G-四平面的8 個(gè)C=O 的O 原子結(jié)合形成
一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[45]。該結(jié)構(gòu)可以與某些大分子結(jié)合直接或
間接產(chǎn)生紫外吸收、熒光、電化學(xué)信號的變化進(jìn)而發(fā)展各
式各樣的生物傳感器。
基于上述原理, Li 等[46]采用鋅卟啉為熒光信號探針,
當(dāng)存在Pb2+時(shí), Pb2+可以與目標(biāo)G 堿基DNA 發(fā)生作用生成
G-四鏈體結(jié)構(gòu), 鋅卟啉分子與G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA 發(fā)生作
用產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號, 從而實(shí)現(xiàn)對Pb2+的檢測。Li 等[47]采用
結(jié)晶紫作為電化學(xué)信號探針, 設(shè)計(jì)了電化學(xué)Pb2+生物傳感
器, 當(dāng)存在Pb2+時(shí)與電極表面生成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)可以與
結(jié)晶紫特異性結(jié)合, 基于結(jié)晶紫的電化學(xué)信號實(shí)現(xiàn)了對
Pb2+的檢測, 檢測限4×10-10 mol/L。Zhai 等[48]利用G-四鏈
體結(jié)構(gòu)與Pb2+的特異性作用及Pb2+自身還原電信號, 設(shè)計(jì)
了Pb2+電化學(xué)適配體傳感器, 根據(jù)-0.365 V 處Pb2+的還原
峰可對其進(jìn)行定量檢測。
此外, Pb2+誘導(dǎo)形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)可以與hemin 分
子結(jié)合并表現(xiàn)出過氧化物酶的活性, 該酶可以催化雙氧水
氧化一些底物分子產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光/比色信號變化, 基于
熒光/顏色變化從而實(shí)現(xiàn)對Pb2+的定量分析?；诖薒i 等[49]
采用AUR 熒光底物分子設(shè)計(jì)了熒光生物傳感器實(shí)現(xiàn)了對
Pb2+的檢測, 檢測限4×10-10 mol/L?；谙囝愃频臋z測原理,
Liu 等[50]設(shè)計(jì)了比色法傳感器實(shí)現(xiàn)了對Pb2+的檢測。該方
法以鄰甲氧基苯酚為信號底物分子(溶液無色, 但其氧化
產(chǎn)物具有明顯的顏色), 基于紫外-可見吸收信號變化從而
實(shí)現(xiàn)對Pb2+的定量分析, 檢測限1×10-9 mol/L。Li 等[51]采
用苯胺為催化底物, 基于其催化氧化產(chǎn)物聚苯胺優(yōu)良的電
化學(xué)特性, 設(shè)計(jì)了電化學(xué)生物傳感器實(shí)現(xiàn)了對Pb2+的檢測,
檢測限5×10-10 mol/L。采用電化學(xué)方法也可以不用電化學(xué)
底物信號分子, 如Lin 等[52]設(shè)計(jì)了haipin DNA生物傳感器,
當(dāng)Pb2+與haipin 作用后生成G-四鏈體結(jié)構(gòu), 基于電化學(xué)阻
抗信號的變化實(shí)現(xiàn)了對Pb2+的檢測, 檢測限5×10-10 mol/L。
之后Lin 等[53]對DNA序列進(jìn)行了改進(jìn), 設(shè)計(jì)了可以同時(shí)檢
測Pb2+, Hg2+, Ag+3 種重金屬離子的傳感器, Pb2+檢測限
1×10-11 mol/L。
3.2 農(nóng)藥核酸適配體生物傳感器
采用核酸適配體對有機(jī)農(nóng)藥進(jìn)行檢測, 其基本原理
是核酸適配體可以與農(nóng)藥分子發(fā)生作用并產(chǎn)生響應(yīng)的構(gòu)型
變化, 從而產(chǎn)生直接或間接的光、電信號變化, 并最終實(shí)
現(xiàn)目標(biāo)農(nóng)藥的定量分析。核酸適配體及農(nóng)藥分子本身均不
存在熒光及電化學(xué)信號, 因此在傳感器的設(shè)計(jì)中需要引入
其他信號探針以便實(shí)現(xiàn)信號的放大、測定。
Wang 等[29]建立了金納米粒子-適配體比色法生物傳
感器, 實(shí)現(xiàn)了對氧化樂果的檢測。其原理是基于不同聚集
狀態(tài)的納米金的顏色存在差異。分散態(tài)的金納米粒子在
520 nm 處有較強(qiáng)的吸收峰(紅色), 加入適配體DNA后適配
體吸附在金納米粒子表面, 此時(shí)加入高濃度氯化鈉, 由于
適配體對金納米粒子體系的穩(wěn)定作用, 體系顏色未發(fā)生變
化; 當(dāng)加入氧化樂果時(shí), 氧化樂果與金納米粒子表面適配
體發(fā)生作用并從其表面脫離, 此時(shí)加入高濃度氯化鈉, 金
納米粒子發(fā)生聚集作用, 在650 nm 處有吸收峰并體系顏
萬方數(shù)據(jù)
第8 期 梁 剛, 等: 核酸適配體生物傳感技術(shù)在食品污染物檢測中的應(yīng)用 2939
色發(fā)生變化(藍(lán)色)。該比色法既可以實(shí)現(xiàn)肉眼對氧化樂果
的定性分析, 又可以根據(jù)吸收峰強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)氧化樂果的
定量分析, 檢測限達(dá)到1×10-7 mol/L?；陬愃频脑? Bai
等[54]建立了金納米粒子-適配體比色法生物傳感器, 實(shí)現(xiàn)
了對水胺硫磷、甲胺磷、高滅磷、毒死蜱、敵百蟲、伏殺
磷等6 種農(nóng)藥的分析檢測。但該方法不足之處是檢測靈敏
度差、選擇性差, 因此篩選更優(yōu)的適配體提高對目標(biāo)農(nóng)藥
的檢測靈敏度及特異性仍需努力。Bala 等[55]將巰基修飾的
適配體修飾于金納米粒子表面, 大大提高了比色傳感器檢
測靈敏度。其檢測原理是先將巰基修飾的適配體修飾于金
納米粒子制備適配體修飾的金納米粒子體系。當(dāng)不存在甲
拌磷時(shí)加入高濃度氯化鈉, 由于適配體對金納米粒子的穩(wěn)
定作用, 金納米粒子不會發(fā)生聚集作用, 體系沒有顏色變
化(紅色); 當(dāng)加入甲拌磷時(shí), 甲拌磷與金納米粒子表面的
適配體發(fā)生作用, 導(dǎo)致適配體構(gòu)型發(fā)生變化, 當(dāng)加入高濃
度氯化鈉后, 由于適配體對金納米粒子的穩(wěn)定作用變?nèi)?
金納米粒子逐漸發(fā)生聚集作用, 導(dǎo)致體系顏色發(fā)生變化
(藍(lán)色)?；隗w系顏色變化可以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)農(nóng)藥甲拌磷的
快速、高靈敏分析, 檢測限1×10-11 mol/L。該傳感器成功
用于蘋果汁中甲拌磷的檢測。
基于金納米粒子的拉曼光譜信號增強(qiáng)作用, Barahona
等[56]采用表面增強(qiáng)拉曼檢測手段制備了檢測馬拉硫磷的
核酸適配體DNA 生物傳感技術(shù)。其原理是制備甲基丙烯
酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合物顆粒并在其表面修飾金
納米粒子, 然后將巰基修飾的適配體DNA 固定到金納米
粒表面, 最終制備得到聚合物顆粒-金納米粒子-適配體微
顆粒傳感檢測球。當(dāng)檢測體系中存在目標(biāo)馬拉硫磷時(shí)會與
微顆粒表面的適配體發(fā)生作用, 基于目標(biāo)農(nóng)藥特征拉曼光
譜信號變化從而實(shí)現(xiàn)對馬拉硫磷的定量分析, 檢測限
1×10-5 mol/L?；诮鸺{米粒子的催化活性, Weerathunge 等
[57]制備了比色法適配體DNA 生物傳感器對啶蟲脒進(jìn)行的
檢測。其檢測的原理是, 金納米粒子具有催化活性, 可以
催化雙氧水氧化3,3',5,5'- 四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽
(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride, TMB)分子并
伴隨顏色變化(TMB氧化產(chǎn)物具有顏色), 單鏈適配體DNA
于金納米粒子與發(fā)生作用后吸附在其表面導(dǎo)致其催化活性
降低。當(dāng)存在啶蟲脒農(nóng)藥時(shí), 啶蟲脒與單鏈適配體DNA 發(fā)
生作用構(gòu)型發(fā)生變化從而脫離金納米粒子表面, 金納米粒
子活性催化活性恢復(fù), 基于溶液顏色變化從而可以實(shí)現(xiàn)對
啶蟲脒的定量分析, 該方法檢測時(shí)間短, 10 min 即可實(shí)現(xiàn)
啶蟲脒的檢測, 檢測限4.49×10-7 mol/L。
Wang 等[58]和Zhang 等[59]篩選了針對甲拌磷、丙溴磷、
水胺硫磷、氧化樂果的廣譜性核酸適配體, 并建立了熒光
核酸適配體生物傳感檢測方法。其檢測原理是設(shè)計(jì)的分子
信標(biāo)(haipin DNA, 一端標(biāo)記熒光基團(tuán), 另一端標(biāo)記淬滅基
團(tuán))及農(nóng)藥分子均可以和適配體發(fā)生作用, 分子信標(biāo)與適
配體發(fā)生作用后分子信標(biāo)打開, 標(biāo)記的熒光基團(tuán)會產(chǎn)生熒
光信號, 而存在農(nóng)藥分子時(shí)會與分子信標(biāo)發(fā)生競爭作用導(dǎo)
致熒光信號強(qiáng)度發(fā)生變化, 基于此實(shí)現(xiàn)目標(biāo)農(nóng)藥的定量分
析。該熒光傳感器對4 種農(nóng)藥具有較高的靈敏度, 檢測限
分別為1.92×10-8、1.34×10-8、1.72×10-8、2.34×10-8 mol/L。
金納米粒子對熒光分子羧基熒光素(FAM)具有淬滅作用,
基于此Dou 等[60]以金納米粒子-熒光分子作為信號探針,
實(shí)現(xiàn)了對水胺硫磷、丙溴磷、甲胺磷、氧化樂果等4 種農(nóng)
藥的檢測。其檢測的原理是將與目標(biāo)農(nóng)藥適配體互補(bǔ)的
DNA 分子設(shè)計(jì)成hairpin DNA 結(jié)構(gòu), 其一端通過Au-S 鍵
固定于金納米粒子表面, 另一端修飾熒光分子FAM, 由于
熒光分子與金納米粒子表面很近, 所以在此狀態(tài)下其熒光
被淬滅。當(dāng)加入農(nóng)藥適配體DNA 后部分hairpin DNA 與適
配體DNA 雜化成雙鏈, 熒光分子FAM 遠(yuǎn)離電極表面, 此
狀態(tài)下其熒光性能恢復(fù)。當(dāng)同時(shí)加入適配體DNA 和目標(biāo)
農(nóng)藥時(shí), 部分適配體DNA會與目標(biāo)農(nóng)藥作用, 剩余的適配
體DNA與金納米粒子表面的hairpin DNA 作用從而產(chǎn)生減
弱的熒光信號變化, 基于熒光信號的變化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)農(nóng)藥分
子的檢測, 4 種農(nóng)藥的檢測限分別為3.5×10-8、1.34×10-7、
3.84×10-7、2.35×10-6 mol/L。此外, 該傳感器亦成功用于柑
橘樣品目標(biāo)農(nóng)藥含量分析, 其結(jié)果與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用
儀分析結(jié)果一致。Tang 等[16]首次報(bào)道了基于熒光量子點(diǎn)的
毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光分析系統(tǒng)及對目標(biāo)農(nóng)藥傳感檢
測方法。在該傳感器的設(shè)計(jì)中, 將農(nóng)藥適配體互補(bǔ)鏈修飾
于熒光量子點(diǎn), 然后與適配體DNA 鏈雜化形成雙鏈DNA
修飾的熒光量子點(diǎn), 當(dāng)存在目標(biāo)農(nóng)藥時(shí)農(nóng)藥分子與適配體
DNA 發(fā)生作用并從量子點(diǎn)脫落, 并產(chǎn)生單鏈DNA 修飾的
熒光量子點(diǎn)。根據(jù)體系單、雙鏈修飾量子點(diǎn)的熒光信號比
從而可以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)農(nóng)藥的定量分析。該傳感方法對甲拌
磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果4 種農(nóng)藥的檢測限分別
為2.0×10-7、1.0×10-7、1.7×10-7、2.3×10-7 mol/L。此外, 該
傳感器對實(shí)際水果樣品中目標(biāo)農(nóng)藥進(jìn)行了加標(biāo)含量分析,
回收率達(dá)到90.5%~104.0%。
適體DNA 雖然對靶分子具有較強(qiáng)的親和力, 但是對
于結(jié)構(gòu)相似的農(nóng)藥分子則特異性較差, 從而難于選擇性識
別共存體系中目標(biāo)靶分子, 這是適體傳感分析方法難以克
服的“瓶頸”問題。因此, 如何結(jié)合其它分析手段實(shí)現(xiàn)不同
目標(biāo)的選擇性識別具有重要的研究意義。Pang 等[61]采用表
面增強(qiáng)拉曼技術(shù)并結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析方法, 建立了有機(jī)磷農(nóng)藥
的表面增強(qiáng)拉曼適配體傳感檢測方法。首先將巰基修飾的
單鏈核酸適配體通過Ag-S 作用固載于銀納米粒子表面,
當(dāng)目標(biāo)農(nóng)藥分子被修飾于銀納米粒子表面的適配體捕獲后,
基于銀納米粒子對目標(biāo)農(nóng)藥特征拉曼光譜信號的增強(qiáng)作用
實(shí)現(xiàn)了對水胺硫磷、氧化樂果、甲拌磷、丙溴磷4 種農(nóng)藥
的定量檢測及識別分析, 檢測限分別是3.4×10-6、2.4×10-5、
4.0×10-7、1.4×10-5 mol/L。
萬方數(shù)據(jù)
2940 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào) 第8 卷
相對于比色及熒光傳感法, 電化學(xué)方法特別是采用
電化學(xué)阻抗技術(shù)作為信號檢測手段時(shí), 不需要引入或修飾
任何信號探針, 如基于啶蟲脒與適配體的特異性作用, Fan
等[62]制備了檢測啶蟲脒的電化學(xué)適配體生物傳感器。其檢
測原理是修飾于電極表面的適配體DNA 與目標(biāo)農(nóng)藥發(fā)生
作用后會導(dǎo)致DNA 構(gòu)型發(fā)生變化, 電極表面DNA 更加緊
湊, 負(fù)電荷密度增強(qiáng), 電化學(xué)阻抗信號增大, 根據(jù)阻抗信
號的變化實(shí)現(xiàn)對的啶蟲脒的定量分析。該傳感器具有較高
的靈敏度, 檢測限1×10-9 mol/L, 并成功用于番茄中啶蟲脒
的檢測。氯硝柳胺是目前主要的殺螺劑, 大量氯硝柳胺的
使用對水體環(huán)境特別是水生生物產(chǎn)生了毒性作用。目前尚
未有其核酸適配體報(bào)道, Liang 等[63]在研究中發(fā)現(xiàn), 氯硝柳
胺在水體系中可以水解成乙醇胺, 而乙醇胺適配體已經(jīng)篩
選獲得, 基于此制備了乙醇胺適配體生物傳感器, 建立了
乙醇胺電化學(xué)阻抗檢測方法, 間接地實(shí)現(xiàn)了對氯硝柳胺的
定量檢測, 檢測限8×10-11 mol/L。
4 總結(jié)與展望
經(jīng)過幾十年的發(fā)展, 核酸適配體生物傳感技術(shù)已經(jīng)
愈發(fā)成熟, 并建立了比色法、熒光法、電化學(xué)法實(shí)現(xiàn)了食
品污染物的檢測。但到目前為止, 現(xiàn)有農(nóng)藥核酸適配體數(shù)
量仍非常有限, 而且對于結(jié)構(gòu)相似的農(nóng)藥分子選擇性較差,
嚴(yán)重限制了農(nóng)藥核酸適配體生物傳感器的開發(fā)及應(yīng)用; 此
外, 雖然有些農(nóng)藥如馬拉硫磷及除草定核酸適配體已經(jīng)篩
選獲得[64,65], 但尚未有生物傳感檢測方法研究。適配體的
諸多優(yōu)點(diǎn)使其具備很大的潛力成為酶、抗體的替代品。雖
然核酸適配體傳感技術(shù)展示了廣闊的應(yīng)用前景, 但改進(jìn)篩
選方法, 提高對目標(biāo)分子特異性或解決結(jié)構(gòu)相似分子選擇
性識別仍是科研工作者未來需努力的方向。
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[J]. J Nucl Acids, 2014, 2014: 1-8.
(責(zé)任編輯: 姜 姍)
作者簡介
梁 剛, 博士, 助理研究員, 主要研
究方向?yàn)镻OPs、農(nóng)藥、重金屬等污染物電
化學(xué)、光學(xué)生物傳感分析。
E-mail: lghbsd2006@163.com
潘立剛, 博士, 研究員, 主要研究方
向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。
E-mail: panlg@nercita.org.cn

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