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實時熒光定量PCR技術在食用油脂檢測中的應用

文檔作者：劉鵬飛1 馬靜1 江曉穎2 劉靜雯1 3 蘇國成1 4 李健1 3, 4* ( , 廈文檔來源： 1. 集美大學食品與生物工程學院 2. 廈門中集信檢測技術有限公司 3. 廈門市海洋功能食品重點實驗室 4. 廈門市食品科技研發(fā)檢測中心		點擊數(shù)：	更新時間： 2025年07月02日
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第8 卷 第2 期 食品安全質量檢測學報 Vol. 8 No. 2
2017 年2 月 Journal of Food Safety and Quality Feb. , 2017
基金項目: 教育部留學回國人員科研啟動基金、福建省教育廳科研項目 (JA15276)、廈門南方海洋研究中心項目 (13PZP002SF24、
14CZP047HJ21)、集美大學科研基金資助
Fund: Supported by the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry, Foundation of
Education Department of Fujian Province (JA15276), Xiamen Southern Oceanographic Center (13PZP002SF24, 14CZP047HJ21) and the
Scientific Research Foundation of Jimei University
*通訊作者: 李健, 副教授, 主要研究方向為食品安全、食品生物技術、天然化合物, E-mail: lijian2013@jmu.edu.cn
*Corresponding author: LI Jian, College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food,
Xiamen Food Research and Inspection Center, Xiamen 361021, China. E-mail: lijian2013@jmu.edu.cn
實時熒光定量 PCR 技術在食用油脂檢測中的應用
劉鵬飛1, 馬 靜1, 江曉穎2, 劉靜雯1, 3, 蘇國成1, 4, 李 健1, 3, 4*
(1. 集美大學食品與生物工程學院, 廈門 361021; 2. 廈門中集信檢測技術有限公司, 廈門 361021;
3. 廈門市海洋功能食品重點實驗室, 廈門 361021; 4. 廈門市食品科技研發(fā)檢測中心, 廈門 361021)
摘要: 熒光定量PCR 檢測技術具有快速、準確的優(yōu)點, 在轉基因食品檢測等領域得到了廣泛的應用。采用
熒光定量PCR 技術進行油脂轉基因、摻假檢測也成為研究熱點。利用不同油料作物所含有的獨特核酸序列, 采
用熒光定量PCR 技術可簡單、高效、快速地檢測出油脂中所含的特定核酸成分, 從而判定油脂原料的構成, 為
打擊食用油脂摻假造假提供判定依據(jù)。植物油的加工過程中都經(jīng)過多個步驟的處理, 其中的核酸降解嚴重, 含
量極低, 所以從植物油中提取出較高質量的DNA 是對油脂進行熒光定量PCR 檢測鑒定的關鍵。本文主要對
油脂DNA 提取方法及存在的難點、引物設計特點和結果分析進行了論述, 以期為今后熒光定量PCR 檢測技
術進一步推廣與應用提供思路。
關鍵詞: 實時熒光定量PCR; 食用油脂; DNA 提取
Application of real-time fluorescent quantitative PCR technology in the
detection of edible oils
LIU Peng-Fei1, MA Jing1, JIANG Xiao-Ying2, LIU Jing-Wen1,3, SU Guo-Cheng1,4, LI Jian1, 3,4*
(1. College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Xiamen Zhongjixin Testing Co.,
Ltd., Xiamen 361021, China; 3. Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food, Xiamen 361021, China;
4. Xiamen Food Research and Inspection Center, Xiamen 361021, China)
ABSTRACT: Fluorescence quantitative PCR technology has been widely used in the detection of genetically
modified food and other fields for its quickness and accuracy, and it also becomes popular in transgenic detection and
adulteration detection of edible oil. By taking advantage of the unique nucleic acid sequence of different species, the
specific nucleic acid composition contained in different oil crops can be detected, and the raw material constituent of
edible oil can be predicated, so as to provide the evidence for administrative organization to punish the adulterations
of edible oil. The quantity and integrity of DNA of edible oil is very low due to the multiple refined processes. It is
critical to get high quality DNA from edible oils for real-time fluorescent quantitative PCR analysis. This article
mainly reviewed methods and existing problems of DNA extraction, primer design characteristics and result analysis,
so as to provide perspectives for further application of real-time fluorescent quantitative PCR in future.
KEY WORDS: real-time fluorescent quantitative PCR; edible oils; DNA extraction
萬方數(shù)據(jù)
526 食品安全質量檢測學報 第8 卷
1 引 言
食用油是居民飲食中不可缺少的一部分, 為有效監(jiān)
控食用油脂安全, 監(jiān)管部門和研究者提出了多種檢測方法
[1,2]。通常主要的油脂檢測指標有酸價[3]、膽固醇[4]、過氧
化值[5]、揮發(fā)性成分[6]等, 主要檢測技術有近紅外光譜[7]、
電導率與極性物質測定[8]、氣相色譜[9]和質譜法[10]等。隨
著各種檢測方法的優(yōu)化, 一些新型的檢測技術也逐漸出現(xiàn),
諸如電子鼻[11]、快速檢測試紙[12]、核磁共振[13]等。具體的
方法應用有: 利用分光光度法特征波長檢測花生油中的棉
籽油[14], 紅外光譜法鑒定橄欖油[6], 氣相色譜法構建特征
模型檢測大豆油中的棕櫚成分[15]等。上述方法有其使用的
優(yōu)點, 但也有其局限性, 如無法檢測油脂的轉基因成分,
無法鑒別使用油脂的摻假使假, 不能分辨出地溝油中的微
生物污染, 電子設備檢測所需的成本較高在實際應用時不
具普遍性等。
核酸作為每個物種的～身份證～, 具有性質穩(wěn)定、特異
性好、PCR 擴增后產(chǎn)生特征片段明顯等特點, 尤其在臨床
檢測方面的應用廣泛。在轉基因食品成為熱門話題的今天,
轉基因成分的潛在危險性不明, 有些產(chǎn)品沒有明確標識轉
基因成分而對消費者產(chǎn)生誤導等負面影響。由于食用油脂
生產(chǎn)原料包括轉基因大豆、油菜籽等, 使得熒光定量PCR
技術成為食用油脂的轉基因成分檢測首選技術, 實現(xiàn)油脂
分子水平檢測成為發(fā)展趨勢[16]。該技術操作簡便, 通過設
備的自動分析可同時檢測幾十個樣品, 整個檢測過程耗時
短。本文主要從食用油脂中DNA 的提取、引物設計、熒
光定量PCR 在油脂檢測中的具體應用和結果分析等方面
介紹實時熒光定量PCR 技術及其在食用油脂安全檢測中
的應用。
2 食用油脂中DNA 的提取
食用油脂包括可食用動物油脂和植物油脂, 植物油
脂根據(jù)提取工藝不同又分為壓榨型和浸提型, 制取時精煉
程度的不同使得壓榨型較浸提型油脂中核酸含量高。但無
論是動物油還是植物油在生產(chǎn)過程中均要經(jīng)歷高溫、脫色
和脫臭等處理, 核酸片段在各個階段發(fā)生不同程度的降解,
破碎后的DNA 片段小于200 bp, 因此實現(xiàn)DNA 分子的富
集是實現(xiàn)熒光定量PCR 技術在油脂檢測中應用的前提。
在提取過程中如何富集和脫脂是能否成功提取到核
酸的關鍵。核酸易溶于水或緩沖液, 油樣中核酸提取液多
采用無菌水、十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl
ammonium bromide, CTAB)緩沖液和三羥甲基氨基甲烷-乙
二胺四乙酸(Tris-EDTA, TE)緩沖液。振蕩提取時, 由于振
速過高易產(chǎn)生乳化層, 因此需要利用有機溶劑消除乳化,
有機試劑可選用正己烷、乙醚和丙酮等; 而對于蛋白含量
較高的原料, 為了減少蛋白質對核酸測定及PCR 過程的干
擾, 將會進一步用氯仿-酚純化DNA。一般要求用于PCR
擴增的模板DNA 純度OD260/OD280 值在1.8～2.0, 若低于
1.8 說明存在蛋白或苯酚的殘留, 模板純度不高。對油脂
DNA 提取而言, 徹底除去苯酚是純化DNA 的關鍵步驟。
在DNA 粗提階段, 通常采用提取液體積與油樣體積
比例為1:10。食用原油中DNA 殘留量較為理想, 而對于精
煉程度很高的商品油可能需要增加油樣比例富集DNA。水
油混合振蕩利于DNA 分子萃取, 而此過程易形成乳化層,
造成水油分相困難, 在后續(xù)的研究中還應確定合適的振搖
條件, 某些顏色較深的原油還會有色素沉淀, 需要根據(jù)不
同油樣種類作相應調(diào)整, 同時配合有機試劑處理。
一般油樣提取步驟如下: ①1 mL 提取液加入1 g 豬油
溶化豬油, 室溫振蕩10 min; ②12000 r/min 離心10 min, 棄
去上層油脂, 再加入溶化豬油, 重復10 次左右, 提取液與
豬油比例約1:10; ③利用CATB 法[17]進行后續(xù)處理, 氯仿-
異戊醇-酚除去有機溶劑, 異丙醇或乙醇沉淀DNA; ④復溶
DNA。同時可以配合離心柱, 使獲得的DNA 純度更高。
3 引物設計[18,19]
設計引物是實現(xiàn)熒光PCR 技術應用的另一個難點。
油脂中殘留的核酸特點是含量低、片段小和特異性不明。
設計時應根據(jù)各物種的特征, 尋找保守區(qū)間且基因片段較
短。通過對本文引用的引物對做了統(tǒng)計歸納, 植物基因擴
增產(chǎn)物片段分布表見圖1, 常用油料作物的引物見表1, 其
中涵蓋了大豆、花生、油菜籽、棕櫚、芝麻、棉花、玉米、
橄欖和葵花籽等常用油料作物。常用植物內(nèi)參基因如表2
所示。為了檢測轉基因原料使用情況, 還設計了專門針對
油料作物的引物以及其內(nèi)參基因(表3)。為了檢測食用油脂
中可能添加的動物源性油脂, 設計了專門針對動物油脂檢
測的引物及內(nèi)參基因(表4)。
圖1 植物基因擴增產(chǎn)物片段分布
Fig. 1 Fragment distribution of amplified plant genes
萬方數(shù)據(jù)
第2 期 劉鵬飛, 等: 實時熒光定量PCR 技術在食用油脂檢測中的應用 527
表1 常用油料作物的引物
Table 1 Primers for regular oil-bearing crops
NCBI 序列號 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 擴增產(chǎn)物
(bp)
來源
大豆
XM_003518752.2 GCCCTCTACTCCACCCCCATCC GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 118 [20]
XM_003518752.2 GCCCATCTGCAAGCCTTTTT GCCGAAGCAACCAAACATG 294 [21]
XM_003518752.2 GATGGATCTGATAGAATTGAC CTCTACTCCACCCCCATC 233 [21]
XM_003518752.2 TCGCCGCTTCCTTCAACTT GCCCATCTGCAAGCCTTTTT 77 [21]
花生
HQ439774.1 GGTGCCAACACAAACTCCAAC GTTACTCCCATAGCCAATCTTCAA 81 [20]
FJ713110.1 GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG CGCTGTGGTGCCCTAAGG 72 [22]
TCAGAATCCCATCCGGTTTC GTGTTAACGCGCATGGAGAT 91 [23]
油菜籽
D13987.1 CCAGTTCTTGGAGCCGCTTGA AAGGGCCAGTCCAAATGCAGA 121 [20]
AF127919.1 GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC 99 [24]
X77576.1 GGTGAGCTGTATAATCGAGCGA GGCGCAGCATCGGCT 104 GB/T
19495.5-2004[25]
棕櫚 AJ236914.1 AGGGCAATTCCTAATGTATTGGAC CGCAGTTAGAGCCGCATTT 109 [20]
芝麻
AF240005.1 CCAGAGGGCTAGGGACCTTC CTCGGAATTGGCATTGCTG 62 SN/T1961.12-201
3[26]
AF240005.1 TTACCAGAGGGCTAGGGACCTT AACTCGGAATTGGCATTGCT 66 [21]
棉花 CGTGGCCTCGCGATCTGA
CTTCCATGCCGCCTCACAAG
CTCAGCGGCGGAGCTACAG
ACCCAGCCCTCCAAAGATT 89 SN/T3577-2013[27]
玉米
JQ083080.1 TGAACCCATGCATGCAGT GGCAAGACCATTGGTGA 190 SN/T
1203-2010[17]
BT065903.1 CGGTGGATGCTAAGGCTGATG AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC 88 [21]
AJ131373.1 TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT 79 GB/T19495.5-2004
BT065903.1 CTCCCAATCCTTTGACATCTGC TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG 151 GB/T19495.5-2004
橄欖
JF738736.1 AATCTTCTACTGGTACATGGAC AGTAACAGAACCCTCTTCAAAT 164
ACTCGCACACACTCCCTTTCC TTTTTAGCTCACTGGCCATCC 115 [28]
AJ001766 GGTGTTATTCCCGTGGCTTCAG ACGGAATCATCCCCAAAGATCTC 80 [29]
AJ001766 AAAGGGCGATGCTACCATATTGA GGGATTCGCAGATCTTCCAGAC 182 [29]
AJ416321 GTTCGCCAAAAGGACCGACAT GCCAGACATGGTGCAGCAGTT 82 [29]
AJ416321 TACACCACGGTCATGCAAGTCC TGGCGAACAGAAGACCGATAATG 193 [29]
葵花籽 CTCGAGCACCTCCGGCT GGATTGGATGGCATTCGG 60 [21]
表2 植物內(nèi)參基因引物
Table 2 Primers for plant housekeeping genes
NCBI 序號 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 擴增長度(bp) 來源
HM850302.1 AATGAAGGACGTGATCTTGC AGTTCAGGACTCCATTTGC 71 [30]
AB861614.1 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 137 [31]
KF600709.1 CGAAATCGGTAGACGCTACG TTCCTAAGAGTCTCTGCACCT 199 SN/T1204-2003[32]
萬方數(shù)據(jù)
528 食品安全質量檢測學報 第8 卷
表3 植物中轉基因成分引物
Table 3 Primers for transgenic ingredients
上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 擴增產(chǎn)物(bp) 來源
大豆
CCGACGCCGATCACCTA GATGCCGGGCGTGTTGAG 87 SN/T 1204-2003
CATTTGGAGAGGACACGCTGA GAGCCATGTTGTTAATTTGTGCC 74 GB/T19495.5-2004
CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG GACTTGTCGCCGGGAATG 121 GB/T19495.5-2004
TAGCATCTACATATAGCTTC GACCAGGCCATTCGCCTCA 85 GB/T19495.5-2004
TCATCCCTTACGTCAGTGAG CCATCATTGCGATAAAGGAAA 165 專利201010596930.X[33]
油菜籽 GTCTTCGTGTTGCTGGAACCGTT GAACTGGCAGGAGCGAGAGCT 121 GB/T 19495.5-2004
棉花
CGTGGCCTCGCGATCTGACT
AAGATGCCTCTGCCGACAGT
CTCAGCGGCGGAGCTACAGA
GCGAAGGATAGTGGGATTGT 196 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACT
TGAATCCTGTTGCCGGTCTT
CTCAGCGGCGGAGCTACAGACG
TATTAAATGTATAATTGCGGGA 184 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACT
GAGTCCGTGGATGCTTTGTTC
CTCAGCGGCGGAGCTACAGA
ATCATGGCGATGTTGGTGTC 111 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTCC
AATACAGTTCCAGCTACAGCTA
CTCAGCGGCGGAGCTACAGA
CACCCACGATGTTACCGAGT 151 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTT
TGAAATTAAAAACCAATGCCAC
CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGA
TGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT 133 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTGG
CTAACATAAGTAGCTGTGAGTGA
CTCAGCGCCGGAGCTACAGA
AGATTGTCGTTTCCCGCCT 194 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTT
GTCATCTATGTTACTAGATCGGGG
CTCAGCGGCGGAGCTACAGAG
CCGAACGCTGTTATCCTCAT 206 SN/T3577-2013
玉米
CGCGACTGGATCAGGTACA TGGGGAACAGGCTCACGAT 76 SN/T 1204-2003
TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT 92 GB/T19495.5-2004
GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGA GGATGCACTCGTTGATGTTTG 113 GB/T19495.5-2004
CCCATCGACATCAGCCTGAGC CAGGAAGGCGTCCCACTGGC 129 GB/T19495.5-2004
TGTTCACCAGCAGCAACCAG ACTCCACTTTGTGCAGAACAGATCT 100 GB/T19495.5-2004
AAAAGACCACAACAAGCCGC CAATGCGTTCTCCACCAAGTACT 127 GB/T19495.5-2004
GAAGCCTCGGCAACGTCA ATCCGGTTGGAAAGCGACTT 133 GB/T19495.5-2004
GCCAGTTAGGCCAGTTACCCA TGAGCGAAACCCTATAAGAACCCT 149 GB/T19495.5-2004
AGGATCTCGTCGTGACCCAT GCACGAGGAAGCGGTCA 183 SN/T1204-2003
ACAAGCACGGTCAACTTCC ACTCGGCCGTCCAGTCGTA 175 SN/T1203-2010
內(nèi)參基因 GTCTACATGTCTCCGGAGAG GCAACCAACCAAGGGTATG 191 SN/T1203-2010
引物 ATCGTTCAAACATTTGGCA ATTGCGGGACTCTAATCATA 165 SN/T1203-2010
CGACAGTGGTCCCAAAGA AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC 74 SN/T1203-2010
萬方數(shù)據(jù)
第2 期 劉鵬飛, 等: 實時熒光定量PCR 技術在食用油脂檢測中的應用 529
表4 動物源性引物
Table 4 Primers for animal ingredients
名稱 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 擴增產(chǎn)物
(bp)
來源
牛β2m CTGCTATGTGTATGGGTTCC GTAGAAAGACCAGTCCTTGC 115 SN/T3496-2013[34]
豬β2m GAAGGTTCAGGTTTACTCACG TCAGCAAATCAATTTCAATCTGG 107 SN/T3496-2013
羊線粒體 TTTCGCCTTTCACTTTATTTTCCC GGGTTGTTGGATCCTGTTTCG 90 SN/T3496-2013
MGH 牛生長激素基因 CCTCAGACGGGTCTTCACCA CGTGTCAGGATTGGGTAAT SN/T2557-2010[35]
BGH 牛生長激素基因 CCGATGGATGTGTTCAGAGCT GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC SN/T2557-2010
牛源性 CAACAGGAATCTCCTCAGACGTAGA GCTAGAATTAGTAAGAGGGCCCCTAA 91 [36]
HOXC5 基因 CGTAGCCAATTCATTCTATA TGGGAAAGTGATGCTTAA 138 [37]
SV40polyA 猿猴空泡病毒 TCACAAATTTCACAAATAAAGC ACATGATAAGATACATTGATGAG 82 SN/T3496-2013
NPTⅡ新霉素-3,-
磷酸轉移酶基因
TATGACTGGGCACAACAGAC CGTCTTGCAGTTCATTCAGG 124 SN/T3496-2013
CMV 啟動子 GTTCCGCGTTACATAACTTACGG AAGTCCCTATTGGCGTTACTATGG 113 SN/T3496-2013
GFP 綠色熒光蛋白 AACCGCATCGAGCTGAAG GTTGTGGCGGATCTTGAAG 150 SN/T3496-2013
內(nèi)參基因引物
AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA 234～262 [38]
AGGGATAACAGCGCAAT GTTCTTGAACTCAGATCACGTAGGACT 149 [39]
引物長度一般在20～30 bp, 擴增產(chǎn)物在50～300 bp。
如圖1 所示, 擴增片段長度多集中于50～150 bp, 更多的在
100 bp 左右, 用于臨床檢測的引物產(chǎn)生的片段都大于200
bp[18,19]。這說明經(jīng)過多重精煉工藝加工的油脂中所含的基
因破壞程度高, 與其他熒光PCR 技術應用對象相比, 基因
模板片段更短, 但結構穩(wěn)定, 最終被保留于油脂中, 可作
為PCR 應用依據(jù)。
通常熒光定量PCR 的反應程序需經(jīng)過94 ℃預變性5
min 后, 94 ℃ 30 s; 50 ℃ 60 s; 72 ℃ 40 s; 運行40 個循環(huán),
72 ℃延伸5 min。退火溫度是反應過程至為重要的環(huán)節(jié), 合
適的退火溫度可保證模板不斷增量, 產(chǎn)生熒光值, 因此本
文對比了植物物種與其他物種的退火溫度, 為將來實時熒
光PCR 應用于油脂檢測提供參考依據(jù), 見圖2。
圖2 退火溫度對比
Fig. 2 Comparison of annealing temperature
(系列1: 其他物種退火溫度; 系列2: 植物物種退火溫度; 圖中樣
本選自本文列出的引物反應條件。)
分別列取了10 種植物物種和其他物種的退火溫度,
從圖線趨勢看出, 大部分退火溫度在60 ℃附近, 系列2 曲
線位于系列1 下方, 表現(xiàn)出溫度降低, 這是由于相應的降
低退火溫度可增加擴增產(chǎn)量, 而油脂中殘留的DNA 模板
整體質量不高, 適當?shù)臏p低退火溫度利于熒光值產(chǎn)生, 但
過度降低會造成非特異性擴增, 使結果呈現(xiàn)假陽性。因此
在引物設計時, 保證引物長度在25 bp, 擴增產(chǎn)物長度在
100 bp, 退火溫度在55～60 ℃, 可有效達到擴增目的。
4 熒光定量PCR 在油脂檢測中的具體應用
4.1 油脂中動物成分檢測
在檢測植物油脂中的動物源成分時, 王立平等[40]建
立的方法可有效檢測豬油-大豆油(質量分數(shù)1%)中的豬油
成分, 并確定提取液選擇TE 緩沖液, 振搖時間不得低于
10 min, 要求油樣體積至少20 mL。范麗麗等[36]建立了對
市售產(chǎn)品中牛源性成分的檢測方法, 其熒光探針法檢測體
系的檢測限低至0.5%, 可檢測1 pg 牛源DNA 的存在, 設
計引物的擴增片段為91 bp, 可為油脂中動物成分檢測提
供依據(jù)。
4.2 油脂中轉基因成分檢測
在油脂中檢測轉基因成分時, 傳統(tǒng)方法采用CTAB、
SDS 裂解液預處理油樣, 水相提取液水浴65 ℃、30 min
萬方數(shù)據(jù)
530 食品安全質量檢測學報 第8 卷
后加入沉淀劑。聞偉剛等[41]建立的DNA 提取方法和試劑
盒提取效果相當, 最終經(jīng)過PCR 鑒定, 檢測出每毫升大豆
原油中的核酸含量為2×10-5 ng。但試劑盒價格較高, 不利
于基層檢測工作開展。陳穎等[42]通過模擬轉基因食用油,
分別提取轉基因大豆和非轉基因大豆的DNA 添加于大豆
油中, 建立的方法可檢測出0.01%的轉基因成分。
4.3 植物油脂中其他類植物油脂成分檢測
周慧等[43]利用實時熒光定量PCR 方法檢測花生油中
摻入的棕櫚油成分, SN/T 1203-2010 提取油脂中DNA, 當
摻入的棕櫚含量達到5%時, 花生油中檢出棕櫚成分
17.431 copies/mL, 含量在3.19 ng 左右。此方法將棕櫚中
提取的核酸混入到花生油中, 模板破壞程度低, 不能完全
模擬棕櫚油, 但在實際運用中可將此法作為參考。油脂制
備原料狀態(tài)對熒光檢測結果的靈敏度也有影響, 以花生為
例, 經(jīng)過部分脫水后的花生其核酸提取率要高于生花生,
同理通過冷榨技術或浸提法的花生油其核酸殘留量低, 實
驗模擬當大豆油中的花生油含量低于20%時便不能被檢出
混入的花生成分[23]。
5 結果分析
5.1 樣品處理條件確定
實時熒光定量PCR 技術用于食用油脂成分檢測為油
脂品控提供了參考依據(jù)。改良CTAB 法對油脂中DNA 的
提取效果較好, 以CTAB 緩沖液為提取液, 油樣體積不少
于20 mL, 每次振搖時間不少于10 min, 高速離心使得
DNA 溶解于水相后, 冷凍過夜并結合DNA 提取試劑盒進
行DNA 純化, 離心過柱濃縮DNA 提取液。通常認為, 提
取液體積越大, 油樣越多, 提取到DNA 的可能性就越高。
但當提取液體積大于10 mL 時, 過離心柱(約1 mL 容量)
的次數(shù)增加, 耗時也相應增加, 往往會造成DNA 損失; 而
減少提取液體積, 多次混合振蕩后, 離心分層后水相會伴
隨油樣被吸出, 最終的提取液中所溶解的DNA 量會有所
降低。對于水油混合可采用搖床振蕩和磁力攪拌的方法,
促進油脂中DNA 溶于提取液。精煉食用油500 mL, 用
1000 mL PBS 緩沖液可提取出0.4 μg DNA[44]。
5.2 引物設計
根據(jù)已報道的NCBI 號, 可查找相應的基因序列, 通
過設定條件產(chǎn)生的引物序列可能被PCR 所用。設計引物堿
基數(shù)不宜過多, 避免引物二聚體產(chǎn)生, 擴增產(chǎn)物不宜過小,
否則易產(chǎn)生假陽性。根據(jù)油脂DNA 的特點, 為了達到良好
PCR 擴增效果, 引物設計長度應在25 bp, 產(chǎn)物大小為100
bp, 設定退火溫度為55～60 ℃。
5.3 結果判斷
與傳統(tǒng)PCR 技術相比, 實時熒光定量PCR 技術具有
特異性強、重復性好、定量準確、PCR 污染少和自動化程
度高等優(yōu)點[45]。整個PCR 過程可通過擴增曲線實時監(jiān)控,
產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系, 可實現(xiàn)
定量分析。
常規(guī)PCR 以電泳結果為準, 將擴增條帶與DNA
Marker 分子量標準對比, 一般認為在對應的分子量區(qū)有條
帶產(chǎn)生, 則說明擴增成功。熒光定量PCR 技術以擴增曲線
為判斷準則, 可進行絕對定量和相對定量。絕對定量可準
確測出DNA含量, 判斷結果準確, 而相對定量法中主要以
Ct 值判斷, 通常當Ct＞40 時, 結果為陰性; Ct 值＜36 時,
結果為陽性; 36＜Ct＜40 時, 實驗應重復后再判斷結果。無
論是絕對定量還是相對定量, 直觀的曲線信息可減少實驗
誤差。常用的熒光定量PCR 方法主要有染料法和探針法。
在染料法中, 熒光染料不存在特異性, 僅識別DNA分子中
雙鍵, 對產(chǎn)生的二聚體等非特異性產(chǎn)物也有熒光信號, 結
果易有假陽性; 而探針法中所設計的核酸探針僅特異性擴
增某段區(qū)域, 其結果更為可靠。目前國家標準中也多采用
探針法進行定量。
6 總 結
食用油脂中核酸片段小、純度低, 但經(jīng)過長期試驗證
明熒光定量PCR 技術可實現(xiàn)油脂品質控制, 尤其是食用原
油?，F(xiàn)已建立的油脂DNA 提取方法使DNA 質量在pg 級
也可滿足熒光定量PCR 的要求; 但在DNA 提取中存在著
影響PCR 過程的因素如酚類、醇類等殘留, 應充分除去以
確保DNA 純度。此外, 對于精煉程度高的油脂需要大量原
料富集, 且提取液的量也會相應增加, 適當次數(shù)的離心過
柱可有效提取其中的核酸, 應設計較大容量的離心柱。同
時合適的引物也是PCR 過程必不可少的。不少植物物種已
經(jīng)公布全序列基因信息, 可選擇代表物種屬性且穩(wěn)定性高
的基因區(qū)間作為設計引物依據(jù), 引物不宜過長, 避免二聚
體產(chǎn)生, 同時不斷豐富引物信息, 真正實現(xiàn)采用熒光定量
PCR 技術對食用油脂的安全監(jiān)控。
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(責任編輯: 姚 菲)
作者簡介
劉鵬飛, 碩士研究生, 學士, 主要研究
方向為食品安全檢測技術、天然活性物質。
E-mail: 1163245636 @qq.com
李 健, 副教授, 主要研究方向為
食品安全、食品生物技術、天然化合物。
E-mail: lijian2013@jmu.edu.cn.

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